【毕业学位论文】水稻叶形控制基因的克隆及其功能研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 水稻叶形控制基因的克隆及其功能研究 士研究生：张光恒 指 导 教 师：钱 前 申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子 研 究 方 向：水稻分子遗传学 培 养 单 位：中国农科院研究生院 中国水稻研究所 提交日期 2007 年 6 月 of 2007 研本究得到 973 计划 发 调：株型育的基因控 （2005863 计划 与 研：水稻卷叶控制基因的克隆功能究（20060110资助 973) (o. G 2005863) (o. 20060110) 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 摘 要 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，叶片形态研究一直备受关注。叶片是植物体进行光合作用的最基本营养器官，大部分叶片形态改变都会影响到植物体的光合作用、蒸腾作用和抗逆性等生理功能，从而极大的影响到植株的生长和发育。 为了研究水稻叶形态建成的控制机制和植物叶片结构组成的分子机理，我们从学诱变粳稻日本晴种子的 77、 样，我们从60射线诱变的籼稻品种双科早处理的 份卷叶突变体材料 研究对这些卷叶突变体进行了等位性检测、叶片细胞形态学切片观察，突变性状遗传分析，卷叶控制基因的图位克隆及功能初步研究，主要结果如下： 一、水稻卷叶突变体 鉴定、遗传分析及基因精细定位 1、等位性检测：对 4 份卷叶突变体进行正反交，并对 株进行表型鉴定。结果表明 个卷叶突变体等位。暂时把这些卷叶突变类型称统为葱卷突变( 分别命名为 2、从叶片细胞形态学切片观察和生理生化测定结果显示，因的突变造成叶片维管束远轴面厚壁细胞的缺失，叶片叶绿素含量增加和纤维素含量的下降。 3、遗传分析： 3 个正常平展叶籼稻品种广四和粳稻品种日本晴作父本分别进行正反交，并对所有的杂交组合的果表明，在所有组合的2代分离群体中的叶片正常株与突变株的分离比符合 3:1。由此我们认为突变体的表型受隐性单基因控制。 4、利用卷叶性状能稳定遗传的 变体（粳稻）与籼稻品种南京 6 号（杂交构建定位群体，运用 记，最终将 因精细定位在第 9 染色体长臂上物理距离为 区间内，共包含 3 个开放阅读框，预测分别编码一个合成蛋白、类似 白。 二、水稻卷叶控制基因 克隆和初步功能研究 1、测序结果表明突变体 因组序列都发生了单碱基的替换（G 到 A） 。根据 平检测发现 突变事件分别发生在同一基因内部两个不同的剪接位点上，导致 能正常剪接。 2、明 确 因位于 隆 103061位置，其 度为5455长为 1134编码 377 个氨基酸。共包含 6 个外显子（和 5 个内含子（。 3、从 结果表明， 因在整个植株个器官中都有不同程度的表达。其中，叶、花和颖壳中的表达量最高，其次是根、最弱的是茎秆和叶鞘部分。 I 4、我们通过构建植物表达载体 化水稻，在 基因植株的整个生长发育阶段，所有部位都能检测到 性，但在各组织器官表达范围存在一定差异。在叶片泡状细胞中没有表达，而在维管束、气孔、导管等疏导组织中都有较强表达。在种子幼芽、叶片（包括叶鞘）、茎秆和种子颖壳中表达范围较广，主要在脉络系统中有较强的表达；而在根中只有中柱鞘、籽粒中只用疏导组织和花中只有雄蕊能检测到蓝色。 5、通过互补试验，结果发现转入 因的卷叶突变体 片表型恢复正常。 三、水稻卷叶突变体 遗传分析及基因精细定位 1、等位性检测结果表明，卷叶突变体 位。由于其卷曲程度没有 重，为区别起见，我们将 27 突变体( 别命名为 2、从叶片细胞形态学切片观察发现， 因功能的丧失造成了维管束两侧、靠近叶片近轴面的泡状薄壁细胞的增加，其维管束细胞结构正常。 3、 过连续多代自交种植，确认突变性状能稳定遗传。对 个组合的确变性状受 1 对隐性基因控制。 4、通过构建 位群体，在,200 多株卷叶表型个体，通过设计子标记，最终将因精细定位在第 2 染色体端粒附近物理距离为 914 个开放阅读框（。 关键词 水稻 ( .)，叶形，因， 因，图位克隆，功能分析 is of in in is a an in to In in to of .) O. 77 28, We 27 92 O. 0We of be as of 、 of of 1by as 2、we of to of of in of in 3、we on of 121of to :1 of by 4、 a O. J6 as a on of , to be a n/to . of is a in of or G ). of at of to 2. 03061of AC of 455 of of 134 a 377 3. to in of in at at 4. to US in in in to no in US in of at at be 5. of of 、27 92 a of by to we 92、 2、of of of in 3、on of of PB、N1 by 4. ,200 in 21 Kb on , to RF .), V 目 录 英文缩略表 .一章 绪论 .引言 .水稻叶片发育、结构 . 植物叶片的发育过程 . 水稻叶片的构造及其特点 . 禾本科 4 植物叶片构造 .植物叶片形态建成分子机制 . 叶片细胞的极性分化 . 叶形态决定的细胞学基础理论 . 叶片形态建成的分子机制 .稻叶片形态与理想株型的关系 . 10 稻卷叶性状类型的分类 . 10 稻叶形态因子判断标准 . 12 已定位和发现的水稻卷叶基因 . 12 卷叶性状的生理生态效应的研究 . 13 水稻突变体库的构建及功能基因克隆方法 . 14 稻突变体库的构建 . 15 物基因的克隆 . 16 因的图位克隆 . 20 位克隆技术在水稻中的应用 . 24 本研究的目的和意义 . 27 第二章 水稻卷叶突变体 鉴定、遗传分析及基因精细定位 .实验材料 . 28 叶突变体的来源 . 28 V 稻卷叶突变体群体组合的配制 . 28 位群体 . 28 用分子生物学试剂 . 29 2. 2 实验方法 . 29 基黄酸乙脂(化学诱变 . 29 射诱变处理 . 29 描电镜 . 30 态解剖学观察 . 30 腊切片植物组织观察 . 31 . 31 绿素含量测定 . 32 合速率测定 . 32 稻 取 . 32 应体系 . 33 泳检测 . 34 定位的 记 . 34 过新发展的 记精细定位 因 . 34 结果与分析 . 35 稻卷叶突变体的等位性测定 . 35 稻卷叶突变体遗传分析 . 35 稻卷叶突变体形态特征 . 36 绿素含量测定 . 39 光合速率的测定 . 40 因的定位 . 40 讨论 . 43 叶与光合作用之间的关系 . 43 胞结构变化 . 44 位材料（穗部）表型差异、互补机制 . 44 叶性状利用 . 45 第三章 水稻卷叶控制基因 克隆和初步功能研究 .实验材料 . 46 实验方法 . 46 变基因测序 . 46 物组织总 取 . 46 . 47 粒的提取 . 47 能互补试验 . 48 构建及转化 . 49 维素含量测定 . 50 结果与分析 . 50 变位点的确定 . 50 长基因的获得与功能的预测 . 52 基因表达 . 53 基因及互补表型观察 . 55 讨论 . 56 第四章 水稻卷叶突变体 遗传分析及基因精细定位 .实验材料 . 58 位性检测 . 58 间杂交及. 58 用分子生物学试剂 . 58 实验方法 . 58 结果与分析 . 59 27 卷叶突变体的等位性检测 . 59 稻卷叶突变体 遗传分析 . 59 叶突变 的形态特征 . 59 稻卷叶 因的精细定位 . 61 论 . 63 第五章 全文结论 .考文献 . 谢 . 者 简 历 .英文缩略表 英文缩写 英 文 全 称 中 文 名 称 菌人工染色体 1粒人工染色体 母人工染色体 类人工染色体 氧核糖核酸 补 因组 糖核酸 核糖核酸 氧核糖核苷三磷酸 霉酸 尖分生组织 放阅读框 基磺酸乙酯 化乙锭 化十六烷三甲基铵 :1:18 福尔马林: 冰醋酸: 酒精=1:1:18 二胺四乙酸 部排列搜索工具 续上表： 英文缩写 英 文 全 称 中 文 名 称 bp 基对 kb 碱基对 摩 单序列重复（微卫星） 列标记位点 达序列标签 割扩增长度多态性 制性片段长度多态性 增片段长度多态性 单片段长度多态性 稻基因组计划 株型 量性状定位 倍单倍体 等基因系 组自交系 合酶链反应 反转录聚合酶链式反应 CR 异显示技术 表性差异分析 制性扣除杂交 互差减 别显示技术因表达指纹法 纤维荧光原位杂交 X 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 第一章 绪论 引言 叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官，绿色植物通过叶片进行光合作用，把光能转变成化学能，是最普遍也是最廉价的能量转化过程，它是地球上一切动物( 包括大多数微生物) 的生命源泉，同时也是人类社会的主要物质和能量的来源。绿色植物产量，包括根、茎、叶、种子等，其中只有 5%物质来自根部吸收的营养物质，而 90%物质则来自作物叶片的光合作用的产物（朱雄涛等， 2003）。叶片千姿百态, 不同植物既有相似相近, 又有貌象迥异的叶形 , 而且同一植物在不同生长时期或不同生长条件下具有不同的叶片形态（李林川等， 2006）。叶的极性建立直接决定了叶形的发育。叶的卷曲形态对一些作物来说是一种非常重要的农艺性状。大部分叶片极性改变都会影响到植物体的光合作用、蒸腾作用和抗逆性等生理功能。了解水稻叶极性建成和叶卷曲发生的遗传规律，对于遗传上控制植株形态，发展叶发育的重要理论，改良叶平展度或卷曲度等遗传性状，提高农作物产量和品质有重要的理论意义和实用价值（余琳，2005 ）。 本实验内容涉及到了水稻叶片发育、叶片形态建成、水稻基因的克隆、基因功能的研究等内容，作者对叶片发育、构造特点和形态建成的分子机制、水稻功能基因组等研究相关内容进行综述。 稻叶片发育、结构 植物发育时，十分有秩序地形成了各种形态。植物体的根端与茎端，存在各种侧生器官。植物中这种具轴的两极向特征，就称之为极性现象。植物形态发生中除了极性现象以外，还有相关现象和对称现象等。植物体的“体轴”不是一种真正的物质结构，而只是一种几何学上的轴或面，由此将植物体或器官分成两面，形成对称。这些沿着轴或纵向面的对称，大致可分为辐射对称、左右对称和腹背对称 3 种类型。叶片是植物体进行光合作用的基本营养器官，它的形态发育极大的影响到植株的生长和发育。典型的叶片结构除了表皮细胞之外，还包括栅栏组织和海棉组织。栅栏组织是一类排列整齐致密的细胞，内含丰富的叶绿体，主要进行光合作用，而下表面的海绵组织则由松散不规则的细胞构成，间或分布着用于气体交换的气孔，以发挥呼吸作用（et 2002 ）。双子叶植物中，具有叶绿体的叶肉组织变化为栅栏组织和海绵组织。叶的正面（向轴一面）有由两层圆柱状细胞组织。但是禾本科植物的叶片中，栅栏组织和海绵组织的区分并不明显，叶肉组织往往由具有几个突起的复杂形状1 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 的。植物不同物种的叶，具有不同的颜色、形状和大小，但每种植物都会尽可能的伸展叶片以吸收更多的光能。 水稻是世界第二大谷类作物，是全球近一半人口的主要食物来源。同时，由于水稻的基因组较小、与其他禾本科作物具有广泛的共线性等优点，成为禾本科作物研究的模式植物。由于水稻品种及生长环境的不同，水稻叶片的大小、长度、宽窄、厚薄、弯直、叶色浓淡、叶片形态（平展度）等均不相同。但一般来说，籼稻比粳稻，早稻比晚稻的叶片长、大、弯、垂。而粳稻的叶片一般叶色浓绿。现在栽培多数高产半矮秆品种都属于籼稻品种，且叶片厚、硬、挺、叶色浓等特点。这些特征都有利于提高光能利用，成了选、育工作的重点选择标准，赋予了水稻叶片的结构研究重要的现实意义。因此现将水稻叶片的形成过程、构成水稻叶片形态上下表面、叶鞘和维管束等主要结构的特征进行简要的叙述。 物叶片的发育过程 总体来说，叶的发生和发育是一个复杂的过程：包括叶原基在顶端分生组织的生成和分化，叶原基极性建立后分化出叶的各个部分，如：叶柄、叶片，托叶等。最后，细胞在已分化出的叶的基本结构框架上，进一步分裂分化，形成具有功能的组织结构，如表皮细胞，栅栏组织，海棉组织和叶脉系统等。 现已明确，叶和花属于植物的侧生器官。是从地上部分的顶端分生组织（ 育而来的（2000 ） 。在 中央，有一团分裂缓慢的细胞，组成 中心区。这些细胞，有点象动物的干细胞，始终处于非分化的状态。在 心区的外围，细胞分裂的速度明显加快，这些快速分裂的细胞，组成了 周边区。在周边区里，有一些成簇的细胞性质开始发生变化，这些细胞称之