【毕业学位论文】芽孢杆菌β-甘露聚糖酶新基因的快速筛选、克隆及表达研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 芽孢杆菌克隆及表达研究 A 博士研究生 ： 李雅楠 指导教师 ： 姚 斌 研究员 申请学位类别 ： 理学博士 专业： 生物化学与分子生物学 研究方向 ： 酶的分子生物学 培养单位 ： 研究生院 饲料研究所 提交日期 2006 年 6 月 2006 中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 芽孢杆菌文作者 李雅楠 专 业 生化与分子生物学 研究方向 酶的分子生物学 指导教师 姚斌 培养单位（研究所、中心） 饲料所 姓名 职称 硕（博）导师 单 位 专 业 签 名 王 璋 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 酶工程 钱世均 教授 硕导 博导 中国科学院微生物研究所 酶分子生物学 评 阅 人 程治军 研究员 硕导 博导 中国农科院作物研究所 生物化学和分子生物学 答辩 主席 范云六 研究员 院士 硕导 博导 中国农科院生物技术研究所 分子生物学 吴乃虎 研究员 硕导 博导 中国科学院遗传与发育生物学研究所 分子生物学 钱世均 研究员 硕导 博导 中国科学院微生物研究所 酶分子生物学 宋 未 教授 硕导 博导 首都师范大学生物学院 分子生物学 莫湘筠 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 酶工程 张志芳 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术研究所 分子生物学 答 辩 委 员 伍宁丰 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术研究所 微生物学 会议记录（秘书） 袁铁铮 论文答辩时间地点 农科院饲料所 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I 中文摘要 一类能水解含有 于半纤维素酶类，主要来源于微生物，植物和低等动物中。 品，饲料，制药和石油开采等很多方面有重要的应用价值。微生物则是产 生物来源的 控制和成本低等优点。 芽孢杆菌是 有较大的工业应用价值。本研究通过对核苷酸序列的比较，设计了一对简并引物，利用 术，建立了一种快速的筛选芽孢杆菌新的 种方法不仅可以快速评估所获得的基因片段的新颖性，而且通过反向方法可以克隆到基因的全长序列。利用此方法，从 16 株产 别克隆了其 过序列比对分析，其中两个基因片段同已发表的 通过反向 到了两个基因的全长序列，分别命名为 册号为 两个基因同已发表的甘露聚糖酶基因序列的最高相似性分别为 通过同源克隆获得另外一个 册号为 上实验结果证实了这种快速筛选新基因方法的有效性。 来源于环形芽孢杆菌 甘露聚糖酶编码基因 大肠杆菌和毕氏酵母中都得到了表达。通过亲和层析，纯化了在大肠杆菌中表达的融合蛋白 分析其酶学性质。最适 最适温度分别为 58；有较好的 定性，在 围内酶活性维持在 75%以上； 比活为 。 另一个来源于环形芽孢杆菌的新的甘露聚糖酶编码基因 样在大肠杆菌和毕氏酵母中得到了表达。通过亲和层析，纯化了在大肠杆菌中表达的融合蛋白 最适温度分别为 60； 间较稳定 , 剩余酶活性在75%以上， 在 ， 仍有 酶活性， 这说明此酶具有很好的 定性。 活的 。 从枯草芽孢杆菌 养液中纯化了 最适 最适温度分别为 50。 60下处理 60 分钟， 持了 90%的酶活性； 比活为 。 金属离子 （除了 和 ， 2酶活性均无明显影响； 编码基因 别在大肠杆菌和毕氏酵母中得到表达，并纯化了酵母表达的融合蛋白 最适 最适温度为 42。同原酶相比， 定性均有所降低 本实验初步建立了一种新基因的快速筛选方法， 利用此方法筛选了三个 实验为对新的 关键词 ： 胞杆菌，新基因筛选，克隆 is an in of it is a of is by in as by is to As an a in A of of A CR be by 6 14 to as by of as of is of of . . . pH of 8 5% of in 9.0 is .0 0.0 of in 1.0 , .8 of to 36 pH 0 0% of 0 h. (g+), 2no on . . . pH 2 in of A in a 录 中文摘要 第一章 引言 酶的来源及诱导 酶来源菌的筛选 酶的作用方式及水解产物 酶的基本性质 酶的分离纯化和活力测定 酶的分类 酶的分子生物学 酶的应用 究的目的和意义 二章 芽孢杆菌 验材料 菌株与质粒 引物合成 试剂盒、工具酶和生化试剂 溶液 培养基 实验仪器 验方法 芽孢杆菌 ( 芽孢杆菌 (诱导产酶 板 段的回收和连接 感受态细胞的制备 电转化 重组子筛选 0 序 1 芽孢杆菌 果与分析 产 测得芽孢杆菌 章小结 三章 环形芽孢杆菌 甘露聚糖酶基因的克隆，表达和 酶的性质分析 验材料 菌株与质粒 1 物合成 试剂盒、工具酶和生化试剂 主要仪器 培养基配制 有关试剂和溶液配制 验方法 基因克隆 原核表达载体 的构建 大肠杆菌中的表达 及检测 核表达载体 构建 毕赤酵母中的表达及检测 大肠杆菌表达的 化 酶学性质分析 结果与分析 基因克隆 基因表达 纯化 性质分析 章小结 四章 环形芽孢杆菌 甘露聚糖酶基因的克隆，表达和 酶的性质分析 验材料 菌株与质粒 引物合成 试剂盒、工具酶和生化试剂 主要仪器 培养基配制 有关试剂和溶液配制 验方法 基因克隆 原核表达载体 的构建 大肠杆菌中的表达及 检测 真核表达载体 构建 真核表达载体 表达及检测 大肠杆菌表达的 化 酶学性质分析 果与分析 基因克隆 基因表达 纯化 性质分析 章小结 五章 枯草芽孢杆菌 甘露聚糖酶基因的克隆，表达 和酶的性质分析 料与方法 菌株与质粒 引物合成 试剂盒、工具酶和生化试剂 主要仪器 培养基 有关试剂和溶液配制 验方法 基因克隆 原核表达载体 构建 大肠杆菌中的表达及检测 真核表达载体 构建 毕赤酵母中的表达及检测 纯化 重组 纯化 果与分析 基因克隆 因表达 蛋白纯化 性质分析 重组的 章小结 六章 讨论 于 向 技术的应用 隆的 大肠杆菌中纯化表达的 酶学性质 化的四个 七章 结论 考文献 谢 者简历 国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，存在于微生物 , 动植物中。 植物半纤维素占植物干重的 35%，仅次于纤维素，是自然界中重要的可再生有机资源。半纤维素是由糖残基通过均一聚合或非均一聚合而形成的一类碳水化合物总称。与纤维素（ 葡聚糖主链） 相比， 半纤维素结构与组成十分复杂 (et 1958; et 1958; et 1972 )。半纤维素分子链较短，并常带有支链，糖残基成分复杂，可以是五员环，也可以是六员环 (包括木搪、甘露糖、半乳糖等 )。甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以 1,4 露聚糖可被分解为甘露糖。甘露聚糖的结构比较复杂，如主链上某些残基被葡萄糖取代或半乳糖通过 要有半乳甘露聚糖（ ，葡萄甘露聚糖（ ，半乳葡萄甘露聚糖（ 。 因此消化甘露聚糖主要是依靠 外还需要几种酶的协同作用，包括： ， 外 ，甘露糖苷酶（ ，葡萄糖苷酶（ 脱乙酰酯化酶（ 支链酶（ 1997） 。 随着对 酶在饲料、造纸、保健食品及生物技术研究等方面均得到了广泛的应用。 的来源及诱导 的来源 (1) 动物来源 动物 海洋软体动物 海洋软体动物短滨螺（ ， ，亮大蜗牛 (等，主要是从其肠道分泌液物中分离纯化而来（ Xu et 2002; et 1995） 。 (2) 植物来源 植物 魔芋球茎（史益敏等， 1990； 杜先锋等， 2000）和种子中，如南欧紫荆 (陶乐平， 1995)、番茄 (et 1997； et 1997)、莴苣 (et 1997)、黄桧 (et 2000)、芝麻 (et 2001)等，与种子的萌发密切相关。 史益敏等人 (史益敏等， 1990) 研究发现：在魔芋球茎发育的过程中始终具有 10 月底收获后，球茎即进入休眠期，这个阶段酶活性保持相对稳定，每毫克蛋白活性约在 4酶单位之间。球茎播种后，顶芽萌动，迅速形成地上复叶，这时球茎中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 中 且随着母球茎的快速消耗和解体，子球茎同时开始形成并膨大，但子球茎中酶活较低。 (3) 微生物来源 细菌中的芽孢杆菌， 如枯草芽孢杆菌 李文玉等， 2000； 余红英等， 2003；罗强等 2003； et 2000； et 1998)、嗜碱芽孢杆菌 杨清香等， 1999；田新玉等， 1993)、地衣芽孢杆菌 张峻等， 2001；杨文博等， 1995)、短小芽孢杆菌 et 1990） 、嗜热脂肪芽孢杆菌et 1999） 、 卵形拟杆菌 1987)；热纤梭菌 1981)；纤维单胞菌属 et 1999)。 真菌中的齐整小核菌 et 1998)， 曲霉如黑曲霉 剑芳等， 2002; 田亚平等 , 1998） ， 木霉中的里氏木霉 和平等， 2003） 、绿色木霉 et 1978)，青霉如 et 1987） ，放线菌中的诺卡氏菌形放线菌 襟等， 2000）等。 微生物来源的 本低、来源稳定、提取方便等明显优点，已在实际生产和基础研究中得到广泛应用 (1983)。 的诱导 大量研究表明， 于大部分产 培养基中添加少量的甘露聚糖就能提高产酶水平。杨文博（杨文博等， 1995）等对地衣芽孢杆菌产酶条件研究表明：以 1%的角豆胶或 1%的魔芋粉为碳源，可使细菌分泌酶活力达到 福绵等（崔福绵等， 1999）研究表明：在液体培养基中添加 4%的魔芋粉可使枯草芽孢杆菌分泌的酶活力达到 96U/萍萍等研究表明：以 4%的魔芋精粉为碳源，可使枯草芽孢杆菌 酶活达到 2800U/酶活水平为现已报道的同类酶中的最高水平（柴萍萍，中国农大学位论文） 。 (et 2003)从 平对厌氧产孢子梭菌 细菌生长过程呈持续低量表达。当培养基中含有甘露聚糖时，会诱导酶的高水平表达。此外纤维素和木聚糖也会使 研究还表明在微生物生长的开始阶段主要是 在随后的生长阶段则是纤维素酶基因表达增多。 此外，其它一些半纤维素类物质或苯酚类化合