【毕业学位论文】小麦（Triticum aestivum L.）高分子量麦谷蛋白1By15 和1 Dx1.5t 基因高效表达载体的构建及转化研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 小麦（ .）高分子量麦谷蛋白 11 士 研 究 生：徐 涛 指 导 教 师：张学勇 研究员 申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子 研 究 方 向：小麦重要性状的功能 基因组学研究 培 养 单 位：作物科学研究所 提 交 日 期： 2006 年 6 月 h. D. of in 006 中国农业科学院博士毕业论文 摘 要 I 摘 要 高分子量麦谷蛋白是一类对小麦面粉的烘烤等品质有重要决定作用的种子贮藏蛋白。 近年来， 研究表明， 11面条加工品质呈密切正相关， 111在所有已分析的小麦品种中， 表达量远低于 1表达量。因此，本文在已克隆该亚基编码基因的基础上，从基因调控入手，研究因在种子发育过程中的表达变化规律，克隆和筛选胚乳特异表达的强启动子，构建载体，并进行小麦转化，为用分子手段进行小麦品质改良提供技术和科学依据。 对 11带者小偃 54、 小偃 6 号、 陕优 225 和偃展 1 号籽粒 白和 现无论翻译水平还是转录水平 表达要明显高于 且在品种间存在一定的差异。对陕优 225 和小偃 54 两个品种中 1因组织和发育时间的表达特异性研究发现， 在胚乳发育特定时期表达，并且表达阶段和表达峰值在品种间存在差异。 根据已知的序列特征，用 克隆了 1部分启动子序列，并克隆了 11 1基因的启动子。序列分析表明 因的启动子序列同源性较高，都具有典型的 因启动子的序列特征，发现 1启动子序列具有明显的特异性。在启动子的瞬时转化实验中， 它们操纵 达水平结果相一致，即 1启动子活性低于 1的启动。此外我们还得到了能启动 表达的 因的启动子 从烟草和水稻中成功克隆了两个已知的基质序列（ 。瞬时表达实验表明，仅在基因表达盒前侧加入 能发挥其促进基因转录表达的作用，反而可能会对基因表达起到抑制作用。 利用内源强启动子 因的启动子）和 列构建了 1 基因枪法和花粉管通道法进行了小麦转化研究。在对 1基因枪法转化中，共转化质粒 转化效率明显高于 交证明有 4 个转基因品系（ 1因的插入； 测到 6 个 通过花粉管通道法进行 1转化， 只有 体得到了 56 个 测为阳性的独立株系。 交证明有 2 个转基因品系（ 1因的插入；经 测有 6 粒（ 子得到了目的蛋白的表达。发现该基因的导入可能干扰了受体品种原有种子蛋白基因的表达，但 交分析证明，转化籽粒低分子量区出现的一些未知蛋白（可能）并不是高分子量谷蛋白的变异体。 对于 步鉴定表明基因枪法转化率平均为 关键词 : 高分子量麦谷蛋白亚基；启动子；瞬时表达；转基因 中国农业科学院博士毕业论文 of an in of it 1of is to a on of 1 4, , 25 to of at at is 4 25 by TIt in a of 111in of In of US it of a of 1in by s by or CR 0 we of 4 T0 of to in 1 by 56 12 to in of MW In in 0 of 录 第一章 文献综述 1 麦遗传转化的研究进展 1 麦遗传转化研究概况 1 麦遗传转化的主要方法及其问题 1 因表达调控元件及载体构建策略 5 源基因的表达与遗传 9 相关研究及其进展 10 小麦加工品质 10 价小麦加工品质的指标 11 传模式 12 麦 结构 13 分子量麦谷蛋白的分离与基因克隆 13 加工品质关系的研究 14 蛋白基因的表达调控 15 分子量麦谷蛋白亚基基因上游调控序列的研究 15 蛋白基因组织特异性表达的调控 16 因表达水平影响因子的研究 17 因的转化研究 18 基因小麦的功能分析 18 因或启动子导入其它种属的研究 19 麦近缘种属高分子量麦谷蛋白基因转化普通小麦 20 论文研究的目的和意义 20 第二章 因的表达分析 22 1译和转录水平表达差异的比较分析 22 料和方法 22 果 25 因在不同组织和胚乳发育时期的表达情况 28 料和方法 28 果 28 论 30 蛋白基因的组织特异性表达调控 30 因的表达调控 31 第三章 因启动子和 列的克隆及 时表达分析 32 分子量麦谷蛋白基因部分启动子序列的克隆与分析 32 料和方法 32 果与讨论 36 分子量麦谷蛋白基因启动子的瞬时转化实验 39 料和方法 39 果与分析 41 论 42 稻和烟草 列的克隆与瞬时转化实验 43 料和方法 43 果 44 论 46 第四章 小麦 48 麦 个表达载体的构建与普通小麦的转化 48 料 48 法 48 果与分析 56 麦 69 料 69 法 69 果 71 论 75 种转化方法的比较 75 体构建策略对基因表达的影响 75 转化法的优势 76 基因过程中的基因沉默 76 基因株系的品质预测 77 第五章 结 论 78 达的研究 78 因启动子及 列的克隆和 时表达实验 78 麦 效表达载体的构建与转化 78 山羊草 79 参考文献 80 主要试剂的配制 92 致 谢 97 作 者 简 历 98 V 英文缩略表） 英文缩写 英文全称 中文名称 分子量麦谷蛋白亚基 哚丁酸 哚乙酸 乙酸 2,4,4,4苄青霉素 bp 基对 牛血清白蛋白 椰菜病毒 花天数 碳酸二乙酯 N,甲基甲酰胺 二铵四乙酸 达序列标签 丙基 基质结合序列 效唑 ,N,N,N， N， N， N一四甲基乙二胺 啉代丙烷磺酸 霉素磷酸转移酶 乙烯凝胶电泳 转录聚合酶链式反应 二烷基硫酸钠 录因子类似的基序 霉素乙酰转移酶 中国农业科学院博士毕业论文 第一章 文献综述 1第一章 文献综述：小麦转基因概况及与品质相关的高分子量麦谷蛋白的遗传转化研究 小麦是世界上广泛栽培的重要粮食作物之一，其种植面积为各大作物之首，在解决世界粮食问题中具有举足轻重的作用。在小麦生产和育种上，世界各国都经历了一个由只重视产量到产量与品质并重，进而发展到重视品质的过程。在我国，多年小麦面积仅次于水稻，为第二大作物，小麦馒头、面条、面包、等是广大民众的日常食品。小麦高分子量（ 谷蛋白亚基的组成和含量对小麦面包的烘烤品质等具有决定性作用。在我国，小麦育成品种中优质亚基的频率显著低于欧洲及北美品种，并因高分子量麦谷蛋白亚基的组成不尽合理，使得小麦面粉的烘烤品质普遍较差。因此，利用分子生物学技术，直接将普通小麦或其近缘种属中的优质基因导入栽培品种，改善我国小麦面粉中 谷蛋白的组成及含量是改良面粉加工品质的一条捷径。 麦遗传转化的研究进展 麦遗传转化研究概况 由于较难建立起适合的遗传转化系统，对小麦、水稻、玉米、大麦等重要禾谷类作物遗传转化的研究进展一直较为缓慢。小麦是最后一个获得成功转化的重要禾本科作物，直至 1991 年，人才开拓性地利用基因枪法转化小麦悬浮细胞，获得了转化的愈伤组织。经过十几年的努力，小麦遗传转化取得了长足的发展，已将抗除草剂、抗病毒、抗逆、抗菌、抗虫、雄性不育、品质相关基因、花发育等多种基因导入了小麦，获得了一批转基因小麦，为外源基因的遗传研究提供了资料。其中，利用转基因技术旨在改善小麦营养、增强品质的研究与实践，主要通过五个途径来实现： 增加蛋白含量； 增加必需氨基酸的含量； 增加 谷蛋白的含量，以改进小麦面粉的烘烤品质； 调整淀粉组成； 生产出具有药用和保健性能的品种（ 001） 。近年来，在这方面已经取得了很大进展，外植体高效再生系统的建立、遗传转化方法的建立与优化、有效筛选系统的建立和筛选标记的去除，以及对转基因在植物中的整合与表达调控的深入研究促进了基因工程技术在小麦遗传改良中的应用 。 麦遗传转化的主要方法及其问题 迄今，植物转基因的方法有基因枪法、农杆菌介导法、电击法、激光微束穿孔法、显微注射法、 乙二醇）法 /渗透法、花粉介导法、硅碳纤维法、 泡法 /直接吸入法、花粉管通道法等。根据需要载体与否，可将这些方法分为两大类，即农杆菌介导的遗传转化和没有转化载体的裸露 直接转化。在禾谷类作物转化方法中应用较早的是 ，最广泛和最成功的是基因枪法，而最有发展前途的是根癌农杆菌介导法（ et 2001） 。转化受体 中国农业科学院博士毕业论文 第一章 文献综述 2有幼胚、胚性愈伤组织、原生质体、子房、成熟胚、授粉后的柱头等，不同转化方法所选用受体有所差异。我们将禾谷类作物基因遗传转化方法及其特点进行了系统的概括（表 。尽管禾谷类作物遗传转化的方法已相当丰富，但其转化效率都还不高，稳定性也不够理想，多数方法在很大程度上受转化材料及基因型的限制，离育种的实用要求还有一定的差距。特别是小麦原生质体培养对基因型依赖性很大、植株再生困难、重复性差，且转基因植株育性低（郭殿京等， 1997） 。直至 1988 年原生质体才培养成功，其研究基础和进展都不够理想，要将其真正应用于实际，仍有大量问题亟待解决。因此，在小麦遗传转化中应用最多、效果最好的仍然是基因枪法。 表 植物常用遗传转化方法的比较 植 物 常 用 遗 传 转 化 方 法 评价内容 农杆菌法 基因枪法 电激法 注射法 花粉管通道法 宿主范围限制 有 无 无 无 无 有性生殖植物 组织培养操作 简单 复杂 简单 复杂 复杂 无 转化可重复性 高 一般 高 一般 一般 低 转化嵌合体 少 无 多 无 无 无 操作复杂程度 简单 较复杂 简单 复杂 复杂 简单 设备要求 便宜 便宜 昂贵 昂贵 昂贵 便宜 转化效率 高 低 较高 低 低 较高 单子叶应用 少 可行 广泛 可行 可行 广泛 因枪法 基因枪法的原理是利用高速金（钨）微粒穿过细胞壁，将附着其上的外源 性愈伤组织、盾片等组织细胞中，然后以某种未搞清的机制进入细胞核并整合到基因组中。 基因枪法在一定程度上避开了采用原生质体转化系统时培养及再生困难的障碍， 且重复性高、操作方法相对简单。由于基因枪法诞生不久就相继在水稻、玉米、大麦、小麦、燕麦、高梁等重要禾谷类作物的转化中获得了成功，而与此同时农杆菌转化法在禾谷类作物中的研究进展却不尽人意，因此， 90年代初基因枪法很快就成为许多禾谷类作物遗传转化的首选方法。 基因枪法的转化效率受多种因素的影响，小麦的组培特性可能是小麦基因枪转化的最大影响因子。尽管成功的报道已经不少，但小麦受体基因型还是相当有限的，转化效率也只有 et 1996；曾君祉等， 1998；梁辉等， 1998） 。此外，小麦转化细胞的再生及分化能力可能是最主要的限制因子。有报道认为，在培养基中添加适当的 落酸）可以使愈伤组织表面细胞变得致密，有利于外源基因进入可分化细胞，以提高转化率。进行适当浓度和时间的甘露醇或山梨醇处理，可使细胞产生一定程度的质壁分离，以减少微粒穿孔后胞液的外渗，也可在一定程度上提高转化效率（ et 1992；梁辉等， 1999） 。轰击时所采用的金（钨）粉颗粒的大小及用量、压力大小、轰击距离等参数同样会影响到转化细胞的伤害程度，从而进一步影响转化效率。 中国农业科学院博士毕业论文 第一章 文献综述 3但随着研究的不断深入，其缺点也越来越明显。首先，基因枪设备昂贵，转化的成本较高；其次，转化的受体材料仍以胚性愈伤组织为主，这类材料受基因型影响较大、转化后筛选时间较长、再生分化能力和转化效率都不够理想；第三，由于基因枪法转化是一个随机事件，转化后的嵌合体、转移基因的完整性、多拷贝及其对基因表达的影响等问题都相当突出。因此，尽可能克服这些缺点，选用和创造适当的小麦材料、改良培养条件、优化转化中的参数，将对提高基因枪法的转化率产生积极的影响，在这一方面开展系统研究目前仍很有价值。 杆菌法 农杆菌介导的植物遗传转化方法因其简单有效、转移基因整合效率高，且整合多发生于转录活跃区，利于外源基因的表达，因而在双子叶植物遗传转化中倍受青睐。尽管单子叶植物不是农杆菌天然的宿主，但这种障碍并非不可逾越。近几年来这方面已取得了重大突破，继农杆菌介导水稻 (et 1994) 转化成功后，在玉米 (et 1996)、小麦 (et 1997)、大麦 (et 1997) 和黑麦 (et 2003)上也相继取得了成功。与烟草等双子叶模式植物相比，农杆菌介导的禾谷类作物的转化要困难的多。 目前用于植物基因遗传转化的农杆菌主要有两种类型：一为根癌农杆菌（ ，它含有能诱导被浸染的植物细胞形成肿瘤的 粒；而另一类为发根农杆菌（ ，它含有能诱导被浸染的植物细胞产生发状根的 粒。其中，以前者应用最多。野生型根癌农杆菌能够将自身的一段 入植物细胞，因此段 有一些激素合成基因，因而导致转化细胞自身激素水平的不平衡从而形成冠瘿瘤。 粒为根癌农杆菌一个约 200 环状质粒，它包括 、毒性区（ ） 、接合转移区（ ）和复制起始区（ ）四部分，其中 和 与冠瘿瘤形成有关，前者决定了 加工和转移过程， 包括 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 等七个操纵子，由24 个基因共同作用，决定着 加工和转移。 以将携带的任何基因整合到植物基因组中，这些基因本身与 转移与整合并无任何关系，仅 右两端的 25 向重复序列为其加工所必需，其中 14 完全保守的，呈 10 和 4 连续的两组，两边界中以右边界更为重要。 受体蛋白 损伤植物细胞分泌物的诱导， 自身磷酸化后进一步磷酸化而激活 白。后者是一种 录活化因子，被激活后可以特异性结合于其他 因启动子上游的一个叫的序列，启动这些基因的转录，其中 因产物可对 行剪切，产生 链，然后以类似于细菌接合转移过程方式将 那里与许多 链结合蛋白）相结合，形成 T 链复合物（ et 1996；et 1999 ） 。在此过程中 结合的功能（ et 1996） 。之后，这一复合物在 引导下，以 入细胞核的 单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体中。研究表明， 先整合到转录活跃区，而且，在与其同源的宿主基因组 度重复区的整合频率较高（ et 1991； et 1992） 。 早在八十年代中期，研究人员就已经发现乙酰丁