【毕业学位论文】白菜类蔬菜锌积累和锌胁迫反应的遗传分析博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 博士研究生学位论文 白菜类蔬菜锌积累和锌胁迫反应 的遗传分析 n n . 士研究生: 武 剑 指 导 教 师: 孙日飞 研究员 王晓武 博 士 申请学位类别: 农学博士 专 业 : 蔬菜学 研 究 方 向: 白菜分子遗传学和分子育种 培养单位: 中国农业科学院研究生院 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 提交日期 2005 年 11 月 n n . r. 005 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 - I - 论文评阅人 纽心恪 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 研究员 曹家树 浙江大学 教 授 候喜林 南京农业大学 教 授 答辩委员会主席 张振贤： 中国农业大学 教 授 答辩委员会成员 马有志 中国农业科学院作物科学研究所 研究员 张凤兰 北京蔬菜研究中心 研究员 马荣才 北京农业生物技术研究中心 研究员 钮心恪 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 研究员 刘玉梅 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 研究员 黄三文 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 研究员 答辩时间与地点 2005 年 11 月 19 日上午 9:00 中蔬卉园宾馆三层会议室 - 摘 要 锌是生物体必需的微量金属元素，作为蛋白质的结构和催化成分参与到许多生理生化反应中。缺 严重影响我国人民身体健康的微营养不良症之一，培育 化性作物是克服 养不良症的新策略。缺 时也是严重影响作物生产的植物营养问题之一，培育高 率的作物新品种是解决植物 养不足的一种更具有环境亲和性的途径。另一方面，土壤重金属污染，包括锌污染，日益严重，传统的土壤修复方法耗费很大，植物修复是上世纪九十年代提出的治理土壤污染的新策略， 是利用重金属超富集植物吸收和积累土壤中的重金属，达到降低土壤重金属浓度的作用。但是，由于已经发现的重金属超富集植物都存在生物量小，生长周期长的缺点，因此这一策略并没有真正在实践中得以应用。白菜类蔬菜是我国栽培面积和产量最大的蔬菜，包括一些生长周期短，生物量相对较大的栽培种群，因此对白菜类蔬菜进行 养性状的遗传分析，一方面可以为改良白菜类蔬菜的营养品质和培育高 率的白菜类蔬菜新品种提供理论基础；另一方面克隆与植物 富集相关的基因，通过基因工程的手段创建能够超量富集 白菜类植物材料，能够为植物修复技术的实际应用创造条件。 基于以上目的， 本论文从以下几个方面对白菜类蔬菜的 累和 迫下的耐性进行了遗传分析： 1. 利用原位噬菌斑杂交法，进行了 富集植物 库筛选，获得了 7 个 累相关候选基因的全长 些序列与拟南芥的同源基因的序列相似性为 86 通过对酵母锌运输缺陷型突变体 铁运输缺陷型突变体 运输缺陷型突变体 功能互补以及提高了野生型对 敏感性， 证明了 有 运输活性； 变体中过量表达挽救了缺 件下植株的生长。由此证明了 为金属转运蛋白参与了植物体的金属积累。 2. 利用 183 个 系构建了大白菜的 锁图谱，该连锁图由 10 个连锁群组成，包括 222 个 记，覆盖基因组长度为 1064记间平均间距为 用这一图谱，对大白菜叶片 K、 10 种矿质元素含量和总磷含量进行了 析，共找到 22 个与叶片矿质元素含量相关的 2 个与叶片总磷含量相关的 些 性状的贡献率在 间。对这一群体的 130个 系作了高 迫下耐性的 析，发现了一个与高 迫下大白菜生长相关的 一个仅在相对更高的 度下出现的 3. 对来自于我国不同地区的分别属于 7 个栽培种群的 184 个基因型的白菜类蔬菜和 2个来自于荷兰和 2 个来自于美国的白菜类植物的 累和 迫条件下的反应进行了调查， 结果表明白菜类蔬菜的叶片 量存在显著差异， 变化范围在 23g 间，叶片中 积累显著相关。地上部或根部的相对生长量均适合于作为参数比较白菜类蔬菜对高 缺 迫的耐性差异。白菜类蔬菜中存在高 迫耐性和 率的显著差异。选出了两个对高 迫具有相对高耐性的基因型和一个具有高 率的基因 - 型。 4. 白菜类蔬菜的不同栽培种群间存在显著的性状差异， 因此白菜类蔬菜为研究植物自然变异提供了良好的试验体系。本研究中比较了绿豆芽核酸内切酶（ 异源双链错配碱基的识别效率，结果表明 够高效检测错配碱基；通过在目的片段 5端添加 物序列，使得 记的 物可以作为通用引物用于不同目的片段的测，从而建立了利用绿豆芽核酸内切酶（ 用 记引物的廉价 系。利用这一体系对不同白菜类蔬菜的锌转运蛋白 源基因的多态性进行了分析，在 676片段中检测到三个单碱基的变异，其中有 2 个分别位于两个内含子区域，另外一个 46的变异虽然位于编码区。 关键词： 白菜类蔬菜； 累；高 性； 率 - n is an by in as a or of n is a in n in in of n in Zn in be n to be in of of in n n to n in On of of is a to It as of to or It a in it 991 as it is to in a in to of It n . a n n . n . be in a to of n . to if n . be MO to n . an of of in n TL . of n . of of . of in of TL of . n . 22 0 066 cM a - V - H of By 22 of %. TL to n in 00 M 00M Zn TL 00M Zn of n n . In 88 . n, Fe n n n of to or n to n n NA We of EL to in NA to to of in of To in we a to by 13 of to RD 13 A IP to to of in is in NA Zn Zn Zn 目 录 第一章 文献综述. 1 1植物锌营养性状的遗传学研究进展 . 2 Zn .物 .物锌效率的遗传学研究进展 .物 .物锌积累和锌毒害耐性相关基因的克隆 . 分子标记在植物营养性状遗传改良中的应用 . 9 物耐低养分胁迫的基因定位 .物耐金属毒害的基因定位 . 白菜类蔬菜分子标记研究进展 . 11 菜类植物分子遗传图谱的构建 .菜类植物 .本研究的目的和意义 . 15 第二章 植物锌富集相关候选基因的克隆及功能分析. 17 1材料与方法 . 17 验材料 .针的制备 . 20 表达载体的构建 .用过表达载体进行 A. .结果与分析 . 27 . .表达载体的构建 .选全长 .讨论 . 44 3.1 . 长 .表达载体的构建 . 金属运输功能 .三章 大白菜分子连锁图谱的构建及叶片矿质元素含量. 46 和总磷含量及高锌胁迫耐性的. 46 1 材料与方法 . 46 料 .法 . 结果与分析 . 48 白菜分子连锁图谱的构建 .片矿质元素含量的 .- .讨论 . 63 白菜 .质元素和总磷含量的 .四章 白菜类蔬菜锌积累和对锌胁迫条件反应的自然变异. 66 1材料与方法 . 66 物材料 .物材料的栽培 .属含量的测定 .结果与分析 . 69 . n 耐性 .菜类蔬菜锌效率（ 基因型差异 .论. 80 第五章 白菜类蔬菜锌转运蛋白. 82 . 82 1材料与方法 . 82 料 .法 .结果与分析 . 84 3 讨论. 88 结 论. .考文献. 91 致 谢. 者简历. 103 附 录. 国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 锌（ 有机体必需的微量元素，作为蛋白质的结构和催化活性成分参与到许多生理生化过程中。人类就有 1000 多个基因编码三个含锌指蛋白结构域的蛋白家族，这占整个32000 个已确定的人类基因的 3%（ 2001）；有至少 2000 个转录因子 (1992)和 300 种酶 ( 1993)的结构和功能的完整需要锌的参与。缺 对人体健康产生不良影响，影响儿童大脑发育，损害神经元的生长，严重的会诱发神经系统疾病（ 2001）。缺锌还会带来视力下降、食欲不振，老年痴呆和动脉硬化等病症 ,易发腹泻、肺炎和疟疾 (， 1998； 2004） 另一方面，缺锌是世界范围内影响作物生产的植物营养问题，全世界 30%土壤缺锌（ 2003）。在我国缺锌土壤的面积达到 40%(王人民等， 1998)，低锌和缺锌土壤主要是石灰性土壤，以黄土和黄河冲积物发育的土壤缺锌最为严重。黄土区土壤和华北、淮北平原的黄潮土有效锌一般低于 g 的缺锌临界量（刘铮， 1994） 。解决这一问题的常规途径是补施锌肥，但由于一些农艺和经济因素，诸如干表土中锌的可利用性会降低、次级表土对锌的束缚、疾病的互作和相对较高的费用，使得补施锌肥常常不是解决作物生产中缺锌问题的有效途径。因此，培育高锌效率的作物新品种是在上述情况下一条更为经济有效和可持续性的策略。 锌虽然是细胞生长必需的微量营养元素，然而同所有的金属一样，过量锌会对有机体产生毒害作用（ 1995） 。长期过量摄入锌，会造成血红蛋白和血清铁蛋白降低，抑制铜锌过氧化物歧化酶的活性，导致铜缺乏，易患铁幼粒红细胞性贫血和中性粒细胞减少症（ 1999） 。采矿业、工业以及农业的发展加速了金属向生态系统的释放，重金属污染已成为危害人类健康的严重环境问题。 治理土壤重金属污染的常规方法包括淋洗和置换，但这些方法的费用高昂，例如美国每年在环境污染治理上的投入是 70，其中30%是用于金属污染的治理（ 1999； 2000)。 植物修复技术是上世纪 90 年代初提出的治理重金属污染的新策略，是利用对重金属有超富集作用的植物材料，从污染土壤或水中吸收、积累重金属，从而达到降低土壤或水中的重金属含量的目的。与理化途径和工程途径相比，植物修复更为经济节约和更具有环境亲和性。但是，植物修复概念提出至今的 15 年多的时间里，这一技术并没有得到大范围的实际应用，首要的限制因素就是没有合适的植物材料。已经发现的对重金属有超富集作用的植物都存在生物量小、生长缓慢的缺点，致使其修复效率大大降低。许多研究者致力于筛选可用于植物修复的金属超富集植物（ 2002） ，已经报道的有至少 45 个属于不同科或属的植物能够超量富集包括 u、 金属以及它们之间不同的组合（ 999） 。随着近年来对植物金属代谢机理理解的不断深入， 一些与超富集植物重金属富集相关的基因已经被分离和克隆，这使得利用基因工程的手段对植物材料进行改良成为可能，从而构建既超量富集金属， 又具有高生物量的植物 ( 2000； 2002)。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 1 植物锌营养性状的遗传学研究进展 植物营养性状是指土壤与植物营养问题有关的植物性状的总称，主要包括养分效率和对矿质元素毒害的抗性（严小龙， 1997）。由于锌在生物体内的重要作用，对锌的积累和锌胁迫条件下维持细胞内 子的平衡的研究日益受到植物生理和遗传学家的重视，近年来也取得了一定的研究进展。 植物体锌积累的研究从多方面展开，涉及锌超富集植物的发现，超富集植物的进化和选择优势，以及植物对锌吸收，运输，淀积的生理学机理等方面，而对植物锌积累和平衡的遗传机理的研究则是深入理解所有这些研究领域的基础。然而，对于控制锌积累的遗传学机理的研究目前还处于初始阶段，仅在有限的几种模式植物上进行了一些研究。 n 超富集植物（ Zn 早在 1865年就有关于生长在德国比利时边境的富含 现在的 够超量积累 003)。但是，对植物超富集现象的研究则相对较晚。直到 1948年， i，可以达到植株干重的 1%，此后，人们对金属超富集植物的研究兴趣日益增强。977年率先使用了 来人们又确定了不同金属的超富集植物的金属含量阀值，其中 0,000g/g 1989）。植物体内通常的 0g 过 300g/g 迄今已经有 15个种的植物被鉴定出具有 1992； 1994），这些植物主要分布在由于采矿或者金属冶炼造成 是分布在这些区域的有些种，例如 也包括一些非富集的材料（ 1997； 2000； 2000）。迄今发现的所有 括 11个种）和 1个种）植物。 i， 能在 00内积累的 5000- 30000 g/g ， 1995； 1997） ， 4000 g/g 2000） ，700g/g 2000） 。由于具有这一特性， T. 累和耐性的分子机理和遗传学研究提供了一个很好的实验体系 (003)。 另一种对 高度耐性和富集能力的植物， 其地上部积累的 度可达 32000 g/ g 不表现中毒症状或生长的降低（ ， 2000） 。而且由于其与近源关系更引起了人们的研究兴趣， A. 全序列测定及大量的研究报道对于研究 A. 金属代谢和积累非常有利。金属富集植物通常在重金属污染区发现，但 A. 金属污染和非污染区都存在（ ， 2000； ， 2000） 。此外 A. 叶片中的 量在群体内和群体间均表现差异，是进行 集遗传学研究的良好材料。迄今所进行的关于植物 集的分子机理的研究大部分是基于这两种模式中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 植物进行的。 物 富集的遗传学研究进展 物 富集的群体遗传学 植物自然群体间存在 累能力的遗传学差异，正是由于这种差异，自然选择才能对超富集的进化发挥作用。超富集和耐性的不同变化模式也有利于理解这些现象之间的关系。此外自然的变异还显示了通过常规育种途径改良植物 累特性的潜力，并可提供与此相关的遗传标记。 体间的差异 当来自于富含金属和不含过量金属的土壤的 不同群体生长在露地，温室和水培条件下时，都表现出对包括 内的重金属的组成型高耐性和超富集性（ 1997； ， 2000） ，说明超富集和耐性是在种的范围内广泛存在的生理特性。但这种耐性程度和超富集能力在同一个种的不同群体间却不一定是相同的。许多研究证明 T. 1996； ， 2000）和 ， 2000）对 富集能力在群体间存在差异。 T. 同来源的群体对 性强弱与土壤的 度是正相关的，而超富集能力在二者间却没有显著的正相关性（ 1997； ， 2000； ， 2000） 。如果对耐性和超富集能力进行调控的是同一机理，那么超富集能力最强的植物就应该起源于金属浓度最高的土壤，但有研究表明 集能力最强的群体恰恰是来源于 染程度最低的土壤（ 1997） ，因此这也从一方面说明耐性和超富集能力是由不同的机理控制的。 此外，植物对 富集的能力与耐性不相关也说明超富集不是在 迫条件下产生的功能，因此超富集表型可能具有其他与土壤 度无关的选择优势，例如防止食草动物和防止病害的作用。目前得到的这方面的研究结果支持了这一假说（ ， 1997； 1999） 。 体内的差异 利用单株上收获的种子， 研究 一群体内姊妹系间的 累浓度的差异，两个不同的实验室都报道了存在显著的 富集能力的遗传差异 （ 1996； 1997） ， 后来的研究也表明 ，2000） 。最近对 行的相似的研究得到了同样的结果（ ， 2002） 。但是这种遗传差异并不是在所有群体内都存在。 此外特别值得注意的是具有最高的平均积累值和最大的遗传差异的群体起源于不含过量金属的土壤。 续变化的表型差异 水培条件下不同来源的 5 个 体的 累的表型分布既不表现双峰， 也非多峰（ 2002） ， 富集能力在种内