【毕业学位论文】高比活木聚糖酶XYN-W的高效表达及其性质改良硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 高比活木聚糖酶 高效表达 及其性质改良 请 人 : 王亚茹 指 导 教 师 : 范云六 院士 申请学位类别: 理学硕士 专 业 : 微生物学 研 究 方 向: 微生物饲料工程 培 养 单 位: 研究生院 生物技术研究所 饲料研究所 提交日期 2006 年 5 月 2006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 中国农业科学院硕士学位论文 作者简历 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 高比活木聚糖酶 高效表达及其性质改良 论文作者 王亚茹 指导教师 范云六 培养单位 生物技术研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 伍宁丰 研究员 硕导 中国农业科学院生物技术研究所 分子生物学章引梅 副研究员 硕导 中国科学院遗传 微生物学 评 阅 人 李 俊 副研究员 硕导 中国农科院农业资源与农业区划研究所 微生物学 答辩 主席 宋 未 教 授 博导 首都师范大学生物学院 分子生物学张志芳 研究员 博导 中国农科院生物技术研究所 分子生物学张 杰 研究员 博导 中国农科院植物保护研究所 微生物基因工程 王 琦 教 授 博导 中国农业大学植物病理系 微生物学 朱昌雄 研究员 博导 中国农科院农业环境与可持续发展研究所 微生物学 答 辩 委 员 答辩时间、地点 2006 年 5 月 26 日, 中国农业科学院饲料研究所 记 录 罗会颖 摘 要 木聚糖是一种由- 木糖苷键连接形成并带有多种取代基的多聚糖，大量存在于饲料植物的细胞壁中。木聚糖可以增加单胃动物消化道内的食麋粘性，降低动物对营养的吸收和饲料消化率，是重要的抗营养因子。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。内切 糖苷键，是一类重要的半纤维素酶, 在饲料中应用可消除饲料中木聚糖的抗营养作用, 同时它还广泛应用于纸浆工业、食品工业及能源工业等众多领域。通过重组微生物反应器高效表达木聚糖酶，尤其是高比活木聚糖酶，提高其发酵效价，以进一步降低生产成本是目前木聚糖酶研究的热点之一。另外，通过对木聚糖酶蛋白进行分子改良，以提高其比活性也是进一步提高木聚糖酶应用潜力的有效途径。 瘤胃微生物源的木聚糖酶是目前发现的比活性最高的天然木聚糖酶。我们将本实验室前期克隆到的来源于瘤胃真菌木聚糖酶基因 按正确的阅读框架整合到毕赤酵母表达载体，通过电击转入毕赤酵母，得到重组子。重组子中表达蛋白的析和酶活性测定表明，木聚糖酶基因 组菌株在 5 聚糖酶白表达量达到 1 mg/活性达到 13000 IU/目前文献报道的木聚糖酶最高表达量高近 4 倍。表达产物经纯化后进行了酶学性质测定，结果表明，以 4 纯化的 U/717.1 .5 mg/000 最适反应温度和分别为 60同时各类金属离子和化学试剂对木聚糖酶 酶学性质来看，它是一种酸性木聚糖酶，且对胰蛋白酶有很好的抗性，这一性质使其有望作为饲料添加剂应用于饲料工业中。另外，该酶对作用环境中的各种离子、表面活性剂、螯合剂不敏感，也有利于此酶在工业上的实际应用。 对白结构分析结果表明其C 端 57 个氨基酸序列为连接序列和锚定区域，我们利用到截短的木聚糖酶基因序列将重组表达载体化进入毕赤酵母，并筛选获得阳性重组子。摇床水平上的析和表达产物的酶学测定研究表明，木聚糖酶基因到分泌表达。表达产物 果表明： mg/0000 mL，比活为 U/433.8 纯化的亲本白相比，其比活性及 酶学性质测定结果表明，白最适反应温度为 60，最适 比， 热稳定性略有提高。部分金属离子对酶活有 1020的增强作用，而抑制 50的酶活性。活性达到 U/于目前报道的木聚糖酶，为木聚糖酶进一步的高效表达和降低生产成本提供了良好的材料。同时，本实验也为有针对性地进行酶分子性质改良提供了新的思路和经验。 关键词：木聚糖酶 高比活性 高效表达 毕赤酵母 性质改良 is a in As a of of of of by of of is a of by an of in to of by in is of of on is an to of is as a of a is by It is by of of mg 3000 IU of of to be of U/mg .5 mg/mL 000mLas pH 0 on of is an is to it is be in as an In is to to be in 7 at of of by a 171at of of as U/mg 433.8 to of on pH 0 of a on n2+up 0 20% 0% up U/is of a of of 录 第一章 综述 况 的分子结构区域 的家族 的理化性质的催化机制的基因工程胃微生物基本情况及分类 胃微生物来源的酶 . 木聚糖酶的应用饲料行业中的应用 造纸工业中的应用 食品和医药行业中的应用 酿酒行业及其它领域中的应用 越性体菌和载体 响外源基因表达的因素及表达条件的优化 研究的目的和意义二章 木聚糖酶 毕赤酵母中的表达及酶学性质研究 验材料 菌株与质粒 试剂盒、工具酶和生化试剂液 培养基 实验仪器法 木聚糖酶基因 高效表达木聚糖酶基因的重组酵母的构建 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 木 聚 糖 酶的纯化 木聚糖酶最适 定性的测定 木聚糖酶最适反应温度和热稳定性的测定 金属子和相关化学试剂对木聚糖酶活性 的影响聚糖酶反应初速度的测定 木聚糖酶 0 木聚糖酶比活性测定1 木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力 果 木聚糖酶酶活性测定标准曲线的绘制 木聚糖酶基因 木聚糖酶基因 重组酵母在 3L 发酵罐中的细胞高密度发酵 木 聚 糖 酶 纯化 最适 定性 不同化学试剂对 活的影响 木聚糖酶0 比活性测定1 木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力 活性改良 料及方法 材料 木聚糖酶 表达载体 构建 表达的木聚糖酶的纯化与酶学性质测定 果 木聚糖酶 因的比活性改良 木聚糖酶高效表达重组酵母的筛选 摇床水平木聚糖酶的表达聚糖酶 酶学性质测定 性质比较 四章 木聚糖酶 饲喂试验 1 木聚糖酶 肉仔鸡生产性能的影响 试验方法验结果与分析 小结 聚糖酶对肉仔鸡表 观代谢能和养分消化率的影响 材料与方法验结果 小结 五章 结论与讨论 论论 考文献 谢 者简历 第一章 综述 第一章 综 述 木聚糖是一种五碳糖，是植物细胞中重要的结构多聚糖，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的 35%。木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一（1995）。 木聚糖广泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等中，但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用；而在造纸制浆过程中富含木聚糖的工业废料往往直接排入水体，导致水质富营养化从而严重破坏生态环境，这些现象在我国尤为突出（孙迅等，1998 ）。而另一方面，作为木聚糖水解产物主要成分的低聚木糖是一种附加值高，市场前景看好的功能性食品添加剂，目前已成为国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一（许正宏等，2001 ） 。因此对木聚糖的有效利用和深层开发已成为目前国内外的研究热点。 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称，它作为一种多酶体系广泛存在于各种微生物中。在近四十年的研究历程中，各国科学家们已从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型和功能的木聚糖酶（孙迅等， 1998；杨瑞鹏等，1990 ） ，并对其酶学性质、催化机制以及分子结构有了比较详尽的研究。随着生物技术的不断发展和进步，特别是基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，对木聚糖酶的了解更加深入，已经分离出多种木聚糖酶基因，并有多种木聚糖酶产品已得到应用（刘相梅等， 2001） 。其中，木聚糖酶在饲料工业、造纸工业、能源工业以及食品医药领域的应用价值，在科学界中已引起广泛关注。 1. 木聚糖的分子结构 木聚糖是一种杂合多糖，是半纤维素的主要组成成分。其主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连。根据糖苷键的类型，木聚糖可分两种，1 ， 4木聚糖和1 ， 3木聚糖。前者存在于陆生植物细胞壁中，它的主链由以1 ，4 糖苷键相连的 D吡喃木糖残基聚合而成；而后者存在于海洋藻类的细胞壁中，其主链由 D吡喃木糖残基通过1 ，3 糖苷键聚合而成( ,1990)。 木聚糖侧链上的取代基主要有乙酰基、 4O 甲基D 葡糖醛酸残基、阿拉伯吡喃糖残基等。这些侧链以共价或非共价形式与木质素、纤维素及其他聚合物相连接，组成植物细胞重要的结构细胞壁（et 1998）。不同来源的木材中，木聚糖以不同形式存在。在阔叶树中木聚糖以 合度为150200，且具有高度的乙酰化；在针叶树中木聚糖是非乙酰化的，以阿拉伯糖- 4合度为 70130；而一年生植物及草中的木聚糖是阿拉伯木聚糖。同型线性木聚糖主要存在于茅草，烟草和海藻中。不同植物或同一植物不同的生长阶段，木聚糖的组成成分及其多聚化程度都有所不同，由于其异质性和复杂性，木聚糖的完全水解需要多种不同类型酶的协同作用( 2004)。不同植物中木聚糖的含量也有所差别，一般硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中木聚糖能占到干重的 15 30%，软材中一般占干重的 7%10% 。在某些一年生植物如小麦、甘蔗、棉子壳中，木聚糖含量非常高，一般含量能达 30%以上（ 1995）。 图 1 1 所示是木聚糖的主要结构特征（朱静等， 1996）。可以看出，木聚糖的主链与纤维素很类似，只是其单体为 D木糖而非 D葡萄糖。一般在 C2 、C 3 位上易乙酰化，葡糖醛酸1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 残基则以 O键连在 C2 位上，阿拉伯糖残基多出现于 C2 、C 4 位上。这些侧链类型及杂合程度的不同直接影响木聚糖的溶解性、天然构象及与其它结构多糖分子的结合情况，因而也极大影响了木聚糖酶的作用方式及效率（et 1999；Li et ，2000）。 图 1木聚糖的结构 况 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称。由于木聚糖分子结构的复杂性，要将其完全水解需要多种酶的参与：如内切 4作用于木聚糖主链，随机的切开木聚糖内部的木糖苷键，将其分解为低聚糖；- 用于木寡糖的非还原性末端，释放出木糖及木二糖。同时由于木聚糖多为异聚多糖，主链和侧链上均有多种取代基团，因此将它彻底水解还需要一些特异性酶的作用，如木聚糖侧链的水解需要- 、- 乙酰木聚糖脂酶(阿魏酸酯酶( 多种水解酶的共同作用( 2004)。另外在海洋微生物中还存在一种 - 1， 3 ， 3 D ,1990）。图 12 为不同木聚糖酶的作用位点。 自然界中多种生物可产木聚糖酶，包括细菌、真菌、放线菌、海藻、原生动物、腹足动物和人。重要的产木聚糖酶微生物包括：黑曲霉（、里氏木霉（浅青紫链霉菌（ 、粪肥杆菌( 简青霉( 。细菌与真菌所产的木聚糖在性质上有一定的差异( 2002)。细菌所产的木聚糖酶具有较好的耐温性和耐碱性，同时其所产的木聚糖酶的纤维素酶活性较低。例如: 产的一种木聚糖酶其最适 为 时在 仍具有 40%的活性( 1992)； 0，在 范围内2中国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 都具有较高酶活性( 1992)； 含有木聚糖的培养基中木聚糖酶的表达量可达到 4049U/它的纤维素酶活性只有 (2000)。而真菌所产的木聚糖酶其产量一般较细菌的木聚糖酶高，在酸性条件下有较高的酶活性，耐受的 围一般在 间，同时它的纤维素酶活性较高。例如 产木聚糖酶活性可达 1244 U/同时其纤维素酶活性也可达 (1987)。除了不同的木聚糖酶以外，许多微生物还可以产生复合木聚糖酶，它们具有不同的物理化学性质、结构、比活性和产量；复合木聚糖酶的底物结合位点不同，对多糖骨架上连续的未取代木糖残基的数目要求不同,同时又具有重复却不相同的特性，从而提高了水解的效率并扩大了水解范围。例如产 15 种胞外的木聚糖水解酶，产 13 种木聚糖水解酶(1985)。造成木聚糖酶多型性的原因很多，或是由于蛋白酶的部分水解，或是由于不同程度的糖基化和酰胺化，或者它们根本就是不同基因的产物（朱静等，1996）。 图 12 不同木聚糖酶的作用位点 12. of by 木聚糖酶一般在木聚糖及木聚糖水解物的诱导下表达，而受到葡萄糖的抑制，但也有组成型表达的木聚糖酶。不同的诱导底物及培养基的组成成分都会影响到木聚糖酶的活力及其产物成分（刘超钢等，1999；孙迅等，1999 ；洪枫等，1998 ；et 1986 ）。在研究 产酶情况时发现，如果用木聚糖作为唯一碳源，它们就会选择性地只产生木聚糖3中国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 酶，当用纤维素作为碳源时，则更多地产纤维素酶。 同一种酶作用于不同的底物，得到的产物也 不同。如橄榄绿链霉菌（ 分子结构域 聚糖酶在结构和性质上有很大的差别。木聚糖酶有的只含有单一区域即催化同木聚糖酶分子在其氨之为区域，即纤维素结合结构域( 根据氨基生的木聚糖酶以玉米芯作为诱导底物时，得到的产物主要有阿拉伯木二糖，阿拉伯木三糖，阿拉伯木四糖（et 1990）。而用米糠作诱导底物时，得到的产物主要有阿拉伯木二糖，阿拉伯木三糖，葡糖醛酸木三糖和甲基葡糖醛酸木三糖（et 1990； et 1994； et 1994）。一些农业副产物玉米芯、麦麸、米糠、秸杆、甘蔗渣等是很多微生物产酶的适宜底物，这为它们的工业应用奠定了基础。 酶不同微生物产生的木区，也有的同时具备催化区和多种非催化区。多区域木聚糖酶分子结构中含有催化区（纤维素结合区（木聚糖结合区（锚定区（连接序列（、重复序列（、热稳定区（及其它未知功能的非催化区等，这些区域担负着不同的生理功能。不同木聚糖酶所包含的区域差别较大，有的仅具有其中的一种或几种，有的则包含以上所有区域（刘瑞田等，1998；et ,1991）。 木聚糖酶的催化区承担着酶的水解功能，并作为该酶分类的基础。虽然不基酸组成的数目和种类上相差很大，但它们的催化区在大小上比较一致，在催化区特定位置的谷氨酸和天冬氨酸对催化特性是非常关键的。同一族的木聚糖酶的催化结构域具有序列同源性， 11 家族木聚糖酶分子有 40%90% 的相似性，而 11 家族和 10 家族之间木聚糖酶催化区的氨基酸序列和催化基团的周围序列无有意义的同源性，这表明两个家族在进化上来源于不同的基因，并具有不同的折叠方式。有些木聚糖酶分子中含有两个 琥珀酸纤维杆菌（6.4 B 两个催化区域，两区域有 同源性。 0 族木聚糖酶的催化区， 1 族木聚糖酶的催化区。对10 族和 11 族木聚糖酶催化区晶体结构的分析表明，第 10 族木聚糖酶催化区形成（/）8桶状结构，而第 11 族木聚糖酶形成折叠结构( 1999)。到目前为止，有六种以上第 10 族木聚糖酶的催化区取得了高清晰度的X 构（et 2000；et 1997）。 木聚糖酶的底物结合区差异较大。一些木聚糖酶的底物结合区对木聚糖有特异性，所以又称木聚糖结合区（et 1999）。一般这些底物结合区并不影响酶的催化活性，但对不溶性底物有着特殊作用。如 的 ，它包含有催化区域及 天然状态下，它既能分解可溶性木聚糖，也能分解不溶性木聚糖，而如果人工除去 就不能降解不溶性木聚糖，但不会影响对可溶性木聚糖的降解效率。所以 ui et 2000）。 在木聚糖酶分子中常含有一种独立的无催化功能的酸序列的同源性，木聚糖酶及纤维素酶可分为 10 多种类型的纤维素结合区，该区域可以和结晶纤维素结合，其主要特征是：( 1)在靠近端和端分别有一个 2)除 个很稳定的 3)带电氨基酸的含量低。将 间区域、连接序列一并4中国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 除去，仅影响酶与纤维素的结合能力，但酶的底物特异