【毕业学位论文】来源于青霉F63的α-半乳糖苷酶的纯化、基因克隆、表达与性质研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 来源于青霉 因 克隆、表达与性质研究 of 博 士 研 究 生：密士军 指 导 教 师：姚 斌 研究员 申请学位类别：理学博士 专 业 ：生物化学与分子生物学 研 究 方 向：酶的分子生物学 培 养 单 位：研究生院 饲料研究所 提交日期 2006 年6 月 of 006 中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 来源于青霉因克隆、表达与性质研究 论文作者 密士军 专 业 生化与分子生物学 研究方向 酶的分子生物学 指导教师 姚斌 培养单位 （研究所、 中心） 饲料所 姓名 职称 硕（博）单 位 专 业 签 名 王 璋 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 酶工程 文华安 教授 硕导 博导 中国科学院微生物研究所 微生物学 评 阅 人 伍宁丰 研究员 硕导 博导中国农科院生物技术研究所微生物学 答辩 主席 范云六 研究员 院士 硕导 博导 中国农科院生物技术研究所 分子生物学 吴乃虎 研究员 硕导 博导 中国科学院遗传与发育生物学研究所 分子生物学 钱世钧 研究员 硕导 博导 中国科学院微生物研究所 酶分子生物学 宋 未 教授 硕导 博导 首都师范大学生物学院 分子生物学 莫湘筠 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 酶工程 张志芳 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术研究所 分子生物学 伍宁丰 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术研究所 微生物学 答 辩 委 员 硕导 博导 会议记录（秘书） 袁铁铮 论文答辩时间地点 午 9:00 农科院饲料所 301# 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、 使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 中文摘要 催化 泛的分布于植物、动物和微生物体内。它不但可以催化 可以催化含 酶在饲料、食品、造纸和医药工业等领域具有广泛的应用前景。然而目前 量较低，成本较高，从而限制了 此利用微生物学和分子生物学的原理和手段，克隆- 半乳糖苷酶基因，构建高效表达和分泌的基因工程菌株来提高- 半乳糖苷酶产量，降低生产成本是解决随这一问题的有效途径。 本研究利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、分子筛层析和电泳技术从青霉 分离纯化到一种- 半乳糖苷酶 酶的分子量为 330 基分子量为 82 蛋白是由相同亚基组成的一种四聚体。经过 定和 S 测序分析，该蛋白为一种新的 用所测的两段内肽的氨基酸序列，设计简并引物，以青霉基因组 模板 据克隆到的 过反向 术得到了该基因的 5上游和 3下游序列。根据该 计恰当的引物，以青霉 丝体总 模板，通过 隆到该 全长序列。通过测序证明该 为 2205 推定为该基因的起始密码子，编码一个含有 734个氨基酸的酶蛋白，N 端 21 个氨基酸为该 测该酶的理论分子量为 78.5 论 成熟蛋白的氨基酸序列中，有 7 个潜在的糖基化位点。与其它的到 该 现它们的序列一致性较低，与紫青霉和单青霉的氨基酸序列一致性分别为 这是首次从青霉属中克隆到糖基水解酶 36 家族的 将编码 ，电击转化宿主菌用 平板筛选阳性转化子。从 100 个转化子中筛选到了 23株表达 中 56#转化子在 3.2 mg/11 U/为国外最高酶活力的 2 倍，是国内构建的 倍。 将重组 半乳糖苷酶进行纯化并进行了酶学性质的研究。天然酶的最适温度为 45，重组酶的最适 40。天然酶与重组酶的最适为 组酶与天然酶对高温都较敏感。天然酶在 之间具有良好的定性，而重组酶在 之间具有良好的定性，它们在常温作用 12 余酶活力都大于 88。天然酶的比活为 ，重组酶的比活为 。天然酶和重组酶都受强烈抑制，原始酶受抑制不显著而重组酶受到完全抑制。它们其它的酶学性质是相似的。重组 子糖和水苏糖。重组 适温度与最适近动物肠道的生理条件，故重组的 关键词：青霉， 离纯化，性质鉴定，基因克隆，异源表达，毕赤酵母I in as is in as is An to is to to to to of An 63, to by a 2 30 on is a of S is a on of to NA of CR to of to of A RF 205 a 34 1 as a in a as of pI of 8.5 ) be in of of of . a of 7 as . . To is of to 6 of by by to 3 in 00 of 6# 11U/mL I in a 3 L to be of as to by of 5 of 0. pH of of to pH 2 in .0 .0 2 .0 8% of of +. is g+is g+. no or on of of as of in of of is to be in 录 中文摘要第一章 引言 料工业 品工业 造纸工业医疗领域 真核生物的表达系统 酒酵母( 达系统醇营养型酵母表达系统 多形汉逊酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母表达系统斯德毕赤酵母表达系统在在饲料添加剂开发上的应用 饲料用酶 激素 抗菌肽 究的目的和意义 二章 一种来源于青霉的新的 材料和方法 材料 V 菌株 试剂和仪器 培养基和培养条件 酶活性测定 蛋白质浓度和分子量的测定 酶的分离纯化 离子交换层析 凝胶过滤层析 泳 非变性 活性染色 非变性梯度凝胶电泳 纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定酶学性质 不同金属离子及相关化学试剂对 . 底物特异性的测定 结果与分析青霉 来源于青霉的 端测序 纯化蛋白的内肽序列的测定 章小结三章 材料和方法 材料 菌株和质粒 引物合成 试剂盒、工具酶和生化试剂 法 青霉 因组 提取 段的扩增 反向 获得 双酶切 泳回收 连接 感受态细胞的制备 电转化 0 筛选重组子1 质粒 大量提取2 列测定、序列一致性比较 结果 获得 反向 克隆及鉴定青霉青霉 青霉 章小结 四章 材料和方法材料 菌株与质粒 引物合成 培养基 试剂及仪器 方法 真核重组表达载体的构建 质粒 处理 酵母感受态的制备 酵母细胞的转化 I 转化子的筛选 目的基因在毕赤酵母中的表达检测 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 结果表达载体的构建和重组质粒的转化表达 瓶水平 组子的 测 酵罐水平 章小结五章 重组与天然 材料和方法 试验材料实验仪器重组 粗酶液的制备 L 层析 子筛层析 蛋白含量的测定泳达产物的脱糖基化 结果重组 天然和重组 重组 不同化学试剂对天然和重组 天然和重组 重组 章小结 六章 讨论 七章 结论 考文献谢 者简介 国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 第一章 引言 1 - 半乳糖苷酶及其分子生物学的研究进展 初是从酵母底面发酵液中提取出来的，加水可以分解蜜二糖，固又称为蜜二糖酶。后来通过对各种碳水化合物为底物研究蜜二糖酶的特性，结果发现该酶的主要作用底物是具有 此又将该酶命名为 孝辉等， 2003）。 够专一性催化糖链非还原末