【毕业学位论文】来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表达博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 来源于橄榄绿链霉菌1 士 研 究 生：杨培龙 指 导 教 师：姚 斌 研究员 申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子生物学 研 究 方 向：酶基因工程 培 养 单 位：饲料研究所 提交日期 2005年6月 1 y n of 2005 中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 来源于橄榄绿链霉菌文作者 杨培龙 专 业生物化学与分子生物学 研究方向 酶基因工程 指导教师 姚斌 培养单位（研究所、中心） 饲料研究所 姓名 职称 硕（博）单 位 专 业 签 名 答辩 主席 宋未 教授 硕导 博导 首都师范大学 分子生物学 宋未 教授 硕导 博导 首都师范大学 分子生物学 文华安 研究员 硕导 博导 中国科学院微生物所 微生物学 叶兴国 研究员 硕导 博导 中国农科院作物所 植物分子生物学 张志芳 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术所 分子生物学 王璋 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵研究院 微生物工程 伍宁丰 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术所 微生物学 答 辩 委 员 王志兴 研究员 硕导 博导 中国农科院生物技术所 植物分子生物学 会议记录（秘书） 石鹏君 论文答辩时间地点 饲料研究所，2005,6,28 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 目 录 中文摘要第一章 引言一节 木聚糖酶及其基因工程其分子生物学聚糖酶分子的结构区域 聚糖酶的理化性质聚糖酶基因及其克隆. 木聚糖酶基因在原核生物中的的表达. 木聚糖酶基因在真核微生物中的表达. 木聚糖酶基因的改造. 木聚糖酶的应用饲料行业中的运用造纸工业中的运用食品和医药行业中的运用酿酒行业及其它领域中的应用二节 利用转基因植物表达饲料用非淀粉多糖水解酶聚糖酶转基因植物研究 外源转基因植物饲喂动物的效果研究问题与展望基因植物表达酶的表达量及其提高源酶与转基因植物的相互影响研究的目的和意义二章 高比活性木聚糖酶 材料与方法验材料验方法 植物表达载体的构建 烟草的遗传转化 转基因烟草的 转基因烟草的 转基因烟草的 重组酶蛋白的组酶的活性分析重组酶的稳定性分析分泌型重组酶的提取及酶活测定 结果与分析小结三章 高比活性木聚糖酶 材料与方法验材料验方法 植物表达载体的构建 马铃薯的遗传转化 转基因马铃薯的 转基因马铃薯的 转基因马铃薯的 重组酶蛋白的 重组酶的活性分析分泌型重组酶的提取及酶活测定 结果与分析基因植株的成型表达木聚糖酶的转基因马铃薯的43 成型表达木聚糖酶的转基因马铃薯酶活性分析基因马铃薯表达木聚糖酶的热稳定性分析基因马铃薯的遗传稳定性小结四章 高比活性木聚糖酶 材料与方法验材料验方法 马铃薯的遗传转化 转基因马铃薯的基因马铃薯的 块茎蛋白质的提取 重组酶蛋白的 转基因马铃薯块茎表达木聚糖酶的活性分析 结果与分析茎特异表达木聚糖酶转基因马铃薯的五章 讨论六章 结论考文献谢者简历 要 木聚糖是一种由量存在于饲料植物的细胞壁中。木聚糖可以增加单胃动物消化道内的食麋粘性，降低动物对营养的吸收和饲料消化率，是重要的抗营养因子。木聚糖的降解可以通过内源性木聚糖酶和木糖苷酶完成。其中木聚糖酶可以将木聚糖降解成低聚木糖和木单糖，在饲料、制浆造纸、食品医药等行业中有着广阔的应用前景。目前木聚糖酶的生产主要在微生物发酵系统中进行，但是转基因植物可以提供一种经济、高效、安全且便于直接饲喂的重组酶生产方式。已经有几种微生物来源的木聚糖酶在烟草，大麦等植物中得到表达，但是酶的表达量和酶活性较低，不能满足工业生产的需要。 来源于橄榄绿链霉菌（1的木聚糖酶有高比活性，已在饲料中作为添加剂应用。本研究首次进行高比活性木聚糖酶转基因植物的研究，并获得了具有高木聚糖酶活性的转基因植株。 首先克隆了块茎特异的马铃薯构建了4种含有木聚糖酶的编码基因携带双35子生物学检测确证了 细胞内和分泌表达的木聚糖酶分子量均为21 基因烟草中表达的木聚糖酶具有正常的生物学活性。木聚糖酶活性表现最高为170 IU/3 IU/是目前报道最高的水平。转基因烟草的叶片蛋白粗提液在不同温度处理后，仍保持木聚糖酶活性，具有稳定性。转基因植株可以正常生长和繁殖，具有遗传稳定性。 马铃薯（.）可以作为植物生物反应器的原料，具有易于转化、遗传稳定且成本低廉的优势，本研究首次利用转基因马铃薯进行组成型和块茎特异性木聚糖酶表达。量最高占叶片总蛋白含量的5%. 细胞内表达的木聚糖酶分子量为21 号肽引导木聚糖酶分泌到细胞间隙表达，分子量为31能存在糖基化修饰。转基因马铃薯叶片蛋白提取液中可以表现木聚糖酶活性，最高为90 IU/0 IU/木聚糖酶在马铃薯块茎中也有表达并表现活性，活性最高为13 IU/利用化获得马铃薯再生植株并诱导块茎产生。块茎特异表现木聚糖酶活性，活性最高为10 IU/转基因马铃薯组成型表达的木聚糖酶具有一定的热稳定性。马铃薯植株具有遗传稳定性。研究的结果表明表达高比活性木聚糖酶的转基因马铃薯具有较高的应用价值。 关键词：橄榄绿链霉菌，高比活性木聚糖酶，转基因植物，烟草，马铃薯，块茎特异表达 I is of a It is of to be in in of is by of ,4to In of us be in be In we 1 in in to 1 of an 5S MV of in of In of 1 kD as as of in or to by of I to of up % of in up 70 IU/g 23 IUin be in of by of 1of 1 kD 1kD in to by to of up % of in up 0 IU/g 10 IUup 3 IU/g by in by be to in up 0IU/g in be 0 0 -4 I be to be as of 国农业科学院博士学位论文 引言 第一章 引言 第一节 木聚糖酶及其基因工程 1. 木聚糖及其结构 木聚糖（一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生物质资源。它存在于植物的细胞壁中以及几乎所有部位（995）。 木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连。根据糖苷键的类型，木聚糖可分两种，1，4木聚糖和1，3木聚糖。前者存在于陆生植物细胞壁中，它的主链是由1，4糖苷键相连的D吡喃木糖残基聚合而成；而后者存在于海洋藻类的细胞壁中，其主链由D吡喃木糖残基通过1，3糖苷键聚合而成(et 1990)。自然界中的木聚糖多为异聚多糖，侧链上连着多种不同大小的短取代基,主要有O乙酰基、4O甲基D葡糖醛酸残基、L阿拉伯糖残基（可进一步与香豆酸、阿魏酸等酚酸相连）等。这些侧链与植物细胞中其它几种结构性多糖（如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等）以共价或非共价键连接，组成植物细胞重要的结构细胞壁（et 1998）。而同型木聚糖分布很少，仅见于茅草，烟草和某些种子的外壳中。不同植物或同一植物不同的生长阶段，木聚糖的组成成分及其多聚化程度都有所不同：硬木木聚糖由O乙酰基4O甲基葡糖醛酰木糖聚合而成，聚合度为150200，且具有高度的乙酰化；软木木聚糖是非乙酰化的，由阿拉伯4O甲基葡糖醛酰木糖聚合而成，聚合度为70130（995）。不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，一般硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的1530%，软材中一般占干重的7%10%。在某些一年生植物如小麦、甘蔗、棉子壳中，木聚糖含量非常高，一般都能高达30%以上。 图1所示是木聚糖的主要结构特征（朱静等，1996），可以看出，木聚糖的主链与纤维素很类似，只是其单体为D木糖而非D葡萄糖。一般在C2、C3位上易乙酰化，葡糖醛酸残基则以O键连在C2位上，阿拉伯糖残基多出现于C2、C4位上。这些侧链类型及杂合程度的不同直接影响木聚糖的溶解性、天然构象及与其它结构多糖分子的结合情况，因而也极大影响了木聚糖酶的作用方式及效率（et 1999; Li et 2000）。 1 中国农业科学院博士学位论文 引言 图1其分子生物学 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称。一个木聚糖分子的完全酶解需要几步酶促反应，作用于主链的有两种酶：，4D，4一般而言，前者从主链内部作用于木糖苷键，将木聚糖分解成低聚糖，而后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖。由于木聚糖是杂合多聚分子，带有多种不同取代基支链，因此将它彻底水解还需要一些特异性酶的作用。例如乙酰酯酶、L阿拉伯糖酶、葡糖醛酸酶、木糖苷通透酶等（995）。 许多微生物可产生木聚糖酶。一种微生物常常产生不止一种类型的木聚糖酶，例如：从34的培养滤液中纯化出5种不同类型的木聚糖酶（杨瑞鹏等，1991），从et 2000）。造成多型性的原因很多，包括蛋白酶的部分水解，不同的糖基化和酰胺化，或者它们根本就是不同基因的产物（朱静等，1996）。 木聚糖酶一般在木聚糖及木聚糖水解物的诱导下表达，而受到葡萄糖的抑制，但也有组成型酶。不同的诱导底物及培养基的组成成分都会影响到木聚糖酶的活力及其产物成分（刘超钢等，1999；孙迅等，1999；洪枫等，1998；et 1986）。在研究果用木聚糖作为唯一碳源，它们就会选择性地只产生木聚糖酶，用纤维素作为碳源时，更多地产纤维素酶。 同一种酶作用于不同的底物，得到的产物也不同。如橄榄绿链霉菌（生的木聚糖酶以玉米芯作为诱导底物时，得到的产物主要有阿拉伯木二糖，阿拉伯木三糖，阿拉伯木四糖（et 1990）。而用米糠作诱导底物时，得到2 中国农业科学院博士学位论文 引言 的产物主要有阿拉伯木二糖，阿拉伯木三糖，葡糖醛酸木三糖和甲基葡糖醛酸木三糖（et 1990; et 1994; et 1994）。一些农业副产物玉米芯、麦麸、米糠、秸杆、甘蔗渣等是很多微生物的适宜底物，这为它们的工业应用奠定了基础。 按照氨基酸序列同源性的不同，参与植物多聚糖类代谢的酶可以分为35个不同的组。木聚糖酶属第10、11组（以前称为F、高分子量的木聚糖酶多属于10组，该组还包括对纤维素和木聚糖都有水解作用的非特异的葡聚糖酶；低分子量的都属于11组。两组在催化特性上有差异（刘瑞田等，1998；et 1993）。实验表明，10组木聚糖酶从葡萄糖醛酸中释放出的最短片段为丁醛酸，从红藻聚糖产生的含糖苷键的最短片段为木三糖异构体，而11组木聚糖酶从前一底物中释放出的最短片段为戊醛酸，从后一底物中产生的含连接的最短片段为木四糖异构体。可见10组比11组分解以上两种多糖更彻底。这些结果表明，10组与底物结合需较少的位点，有较低的特异性；10组比11组对较短的寡聚糖有较高的亲合性。另外这两组酶在净电荷、不带电荷的碱性和酸性氨基酸的比例等方面也都有所不同。 同微生物产生的木聚糖酶在结构和性质上有很大的差别。有的木聚糖酶只含有单一催化区，也有的木聚糖酶同时具备催化区和多种非催化区。多区域木聚糖酶分子结构中一般含有催化区（D）、纤维素结合区（木聚糖结合区（连接序列（重复序列（热稳定区（其它未知功能的非催化区等。这些区域担负着不同的生理功能。不同木聚糖酶所包含的区域差别较大。有的仅具有其中的一种或几种，有的则包含以上所有区域（刘瑞田等，1998；et 1991）。 木聚糖酶催化区承担着酶的水解特性，可以作为该酶分类的基础。木聚糖酶的氨基酸数量变化很大，但其催化区在大小上都趋向一致。在催化区特定位置的谷氨酸和天冬氨酸对催化特性是非常关键的。有些木聚糖酶分子中含有两个来源于蝉琥珀酸纤维杆菌（85）两个催化区域，同源性。区域属于10和11组木聚糖酶催化区晶体结构的分析表明，第10组木聚糖酶催化区形成（/）8桶状结构，而第11组木聚糖酶形成折叠结构。到目前为止，有六种第10组木聚糖酶的催化区取得了高清晰度的Xui et 2000; et 1997）。 木聚糖酶的底物结合区差异较大。根据氨基酸序列的同源性，木聚糖酶及纤维素酶可分为10多种类型的纤维素结合区（一些木聚糖酶的底物结合区对木聚糖有特异性，所以又称之为木聚糖结合区（et 1999）。一般这些底物结合区并不影响酶的催化活性，但对不溶性底物有着特殊作用。如的包含有催化区域及天然状态下，它既能分解可溶性木聚糖，也能分解不溶性木聚糖，而如果人工除去就不能降解不溶性木聚糖，但不会影响对可溶性木聚糖的降解效率。所以ui et 2000）。 木聚糖酶分子中的各功能区域是由连接序列相连，此序列的长度变化很大，一般为659个氨基酸（et 1994）。木聚糖酶的连接序列的组成和功能与某些免疫球蛋白、核糖体3 中国农业科学院博士学位论文 引言 蛋白、丙酮酸脱氢酶复合物中的连接序列相似，该序列中或含有较多的丝氨酸残基，或含有较多的脯氨酸残基，不同来源木聚糖酶的连接序列之间同源性一般不高。这些连接序列将不同的功能区域连接起来，形成柔韧可伸展的绞链区。 在许多木聚糖分子中都含有重复序列，其长度为20150个氨基酸残基，重复序列也不是酶发挥活性所必需的，有人认为它是连接序列的一部分或担负有其它功能，但具体作用尚不清楚（刘瑞田等，1998）。 另外，在某些微生物中有某些区段可增加相应酶的最适作用温度，可称为热稳定区（et 1995; et 1995）。这方面的报道还不算太多，有待更多研究证实。 聚糖酶的生物化学性质的获得主要来自于细菌和真菌木聚糖酶的研究。细菌所产木聚糖酶可大体分为两类：高分子量的耐酸木聚糖酶，低分子量的耐碱木聚糖酶。但在真菌中，却没有这种差别，不过，低分子量木聚糖酶的耐碱性却是共同的。根据多种木聚糖酶的氨基酸组成及其三维结构分析可以看出，谷氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸对其催化特性及耐碱、耐热性等是非常