【毕业学位论文】溶栓相关蛋白基因在细菌、酵母及植物中的表达与研究博士论文

密级： * 论文编号 中国农业科学院 学位论文 溶栓相关蛋白基因 在细菌、酵母及植物中的表达与研究 of . 博 士 研 究 生：魏昭荣 指 导 教 师：刘德虎 研究员 申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子 研 究 方 向：蛋白表达系统建立与应用 培 养 单 位：生物技术研究所 研究生院 提交日期 2007 年 6 月 of . 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：魏昭荣 时间： 2007 年 6 月 20 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 研究生签名：魏昭荣 时间： 2007 年 6 月 20 日 导师签名：刘德虎 时间： 2007 年 6 月 20 日 中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 溶栓相关蛋白基因在细菌、酵母及植物中的表达与研究 论文作者 魏昭荣 专 业 生物化学与分子生物学研究方向 蛋白质表达系统建立与应用 指导教师 刘德虎 培养单位 （研究所、 中心） 生物技术研究所 姓名 职称 硕（博）导师 单 位 专 业 签 名 硕导 博导 硕导 博导 评 阅 人 硕导 博导 答辩 主席 成卓敏 研究员 硕导 博导 农科院植物保护研究所生物化学与分子生物学 成卓敏 郭三堆 研究员 硕导 博导 农科院生物技术研究所生物化学与分子生物学 郭三堆 辛志勇 研究员 硕导 博导 农科院作物科学研究所生物化学与分子生物学 辛志勇 贾继增 研究员 硕导 博导 农科院作物科学研究所生物化学与分子生物学 贾继增 马有志 研究员 硕导 博导 农科院作物科学研究所生物化学与分子生物学 马有志 俞梅敏 研究员 硕导 博导 北京大学生命科学院 生物化学与分子生物学 俞梅敏 邱德有 研究员 硕导 博导 中国林科院林业研究所生物化学与分子生物学 邱德有 会议记录（秘书） 雷阳梅 论文答辩时间地点 2007 年 6 月 20 日 生物技术所 218 会议室 要 本论文主要分为两个部分： 大肠杆菌及毕赤酵母中的表达与研究；蚓激酶在苜蓿中的表达与研究。 大肠杆菌和毕赤酵母也是目前常用的两种微生物表达系统，它们均具有操作简便、培养周期短和易于大规模生产的特点。 吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 2（ 2） 原是一种天然来源的、具溶栓作用的蛋白类物质，它在溶解血栓时，具有特异性好和选择性强的优点，是目前应用前景最好的第三代溶栓药物之一。苜蓿表达体系虽然有许多优点，但苜蓿遗传转化周期长，所以首先探索其在细菌及酵母中的表达，从理论和实践上都具有十分重要的意义。 本研究论文首先探讨了在大肠杆菌中表达和生产 2 重组蛋白的可行性。 通过将本人合成的 因导入大肠杆菌，实现了 细菌中的高效表达，表达的重组蛋白约占细菌总蛋白的 32%。该重组蛋白主要以包涵体的形式存在，通过用多种方法进行复性，但仍未得到有纤溶活性的表达产物。利用大肠杆菌表达的 2 重组蛋白，分别制备了其大鼠和小鼠的高效价抗血清。 在大肠杆菌表达研究的基础上，按照酵母偏爱密码子，对 码序列进行了优化并合成了全新的 因。通过构建不同种类的高效表达载体，实现了 毕赤酵母中的分泌型表达，而表达量在摇瓶水平上达到了 25。更重要的是，表达产物经纤维平板检测，具有较强纤溶活性。经硫酸铵沉淀和一步分子筛柱层析，可得到较高纯度的 物制品，酶比活性达到了 05IU/研究为规模化生产 定物质基础。 苜蓿作为一种重要的牧草，具有产量高、适应强、品质优以及易于贮存和加工的优点，用它作为生物反应器生产的蛋白类药物可直接口服，便于生产和推广。蚓激酶作为一种具有强烈溶栓作用的蛋白酶，不仅副作用极小，而且还可以口服给药，因此被认为是一种比尿激酶、链激酶和更有应用前景的溶栓剂。在苜蓿中表达蚓激酶单一组分，开辟了利用植物生物反应器生产蚓激酶的新领域，为今后蚓激酶药物在临床上的更广泛应用奠定了物质基础。 为实现溶栓相关蛋白基因在苜蓿中的表达与生产，本研究首先建立了苜蓿的组织培养再生。通过多品种苜蓿的筛选及两种苜蓿再生体系的比较，得到了几株易再生的保定苜蓿无菌苗。在苜蓿组织培养预研究的基础上， 对其转化条件也进行探索， 包括确定了卡那霉素最适合的工作浓度。此外，以特美汀取代羧苄青霉素来来抑制农杆菌，也取得了较好的转化效果，转化效率平均能达到 15%，最高可达 30%。利用此转化系统，成功地将蚓激酶组分 因分别导入到保定苜蓿中。获得的再生植株，经一系列分子生物学及蛋白表达检测，结果表明，转基因苜蓿中表达了这两种蚓激酶。本研究为以后利用植物生产蚓激酶及 供了十分有意义的工作基础。 关键词 ：吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂 2，原核表达，毕赤酵母，蚓激酶基因，转基因植物 of in (2) is in is in or is a is of by of in or is a in of in to in is so in of is of in A in to in of in 2% of by a by it as In to in a 5 in by 0% a of of As a of in be by As a of so it is a is of in of in A in to on as It a 20g/mL of 录 第一部分 吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂 2 基因的人工合成 及其在酵母和细菌中的表达 第一章 绪论 .赤酵母的研究进展.肠杆菌表达体系的研究进展. .溶酶原激活剂的研究进展. .研究的目的和意义. .二章 吸血蝙蝠纤溶酶激活剂 2 基因的人工合成 .料与方法. . 材料. . 方法. .果与分析. . 因的密码子优化. . 因的合成. .结. 15 第三章 吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂 2 基因在细菌中的表达.料与方法. 材料. . 方法. .果与分析. . 20 核表达载体 构建. . 重组蛋白的表达与检测. . 重组蛋白 纯化. . 复性后重组蛋白纤溶活性的测定. . 抗体效价测定及重组蛋白的 析. .论. 25 结. 25 第四章 吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂 2 基因在毕赤酵母中的表达.料与方法. 材料. . 方法. .果与分析.母表达载体的构建. . 酵母重组子的菌落 测. . 酵母多拷贝转化子的筛选. . 诱导表达的目的蛋白的检测. . 目的蛋白的纯化. . 纯化后 组蛋白纤溶活性的测定. .论. 结. .五章 结论 .考文献 .二部分 蚓激酶基因 苜蓿中的遗传转化 第一章 绪论. .物生物反应器的研究进展.蓿遗传转化的研究进展.激酶的研究进展.基因植物的生物安全性. .研究的目的和意义.二章 苜蓿再生体系的建立. .料与方法. 材料. . 方法. .果与分析. 组培体系 1 再生苗的获得. . 组培体系 2 再生苗的获得. .论. 57 结. 58 第三章 植物表达载体的构建. .料与方法. 材料. . 方法. .果与分析. 植物表达载体的构建. .结 .四章 苜蓿的遗传转化与转基因植株的检测 .料与方法. 材料. . 方法. .果与分析. 苜蓿转基因植株的获得. . 转基因植株的 测. . 转基因植株的 测. . 转基因植株的 测. . 转基因植株再生的 性检测. .论. .结. 82 第五章结论. .考文献. .研究创新点. .谢. .者简历. . 语 S an kb D TR CR NA n,n,n,n苄青霉素 醇氧化酶 乙酰丁香酮 腺苷三磷酸 6543磷酸 碱基对 氯霉素 十六烷基三乙基溴化铵 地高辛 吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂 2 乙二胺四乙酸 异丙基 卡那霉素 千碱基对 千道尔顿 萘乙酸 光密度 聚合酶链式反应 反转录 霉素 十二烷基磺酸钠 转移并整合的 段 特美汀 N,N,N,N三羟甲基氨基甲烷 基因的非编码区 of of of in in in P. 中国农业科学院博士学位论文 第一部分第一章 绪论 1第一部分 吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂2 基因的人工合成及其在酵母和细菌中的表达 第一章 绪 论 赤酵母的研究进展 巴斯德毕赤酵母（ 一种能利用甲醇的酵母，它可以在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长（ ， 1969） 。毕赤酵母在其代谢过程中可以表达产生过氧化物酶，其中醇氧化酶（ 甲醇利用途径中的第一个酶，当以甲醇为唯一碳源时，甲醇可被氧化成甲醛和过氧化氢（ ， 1991） 。 动子受甲醇诱导，其操纵的转录全程受到甲醇的严格调控。在 动子的控制下，外源蛋白基因在毕赤酵母中的表达易于调控，并且能达到很高的水平。作为真核表达系统，毕赤酵母表达的外源蛋白与其它高等真核生物产生的蛋白非常近似，而且在表达过程中，外源蛋白能够进行正确的翻译后加工，并产生有生物活性的蛋白。毕赤酵母表达系统还具有操作简便，培养经济，易于高密度发酵，表达量高等优点，能进行低成本的大规模生产 ( , 1994； ， 2001)。因此，毕赤酵母表达系统已成为最广泛使用一种表达体系之一。目前，在毕赤酵母中表达的外源蛋白已达上百种（ , 2001） ，其中有些已开始进行商品化生产。 母宿主菌的种类 毕赤酵母表达所采用的宿主菌最早从在 20 世纪 80 年代以后才陆续开发出来的，最初起源于对野生型石油酵母 改造（ ， 1985； ， 1987; ， 1985） 。大部分改造后的菌株都有一个或多个营养缺陷型突变或抗性选择标记以供转化后重组子的筛选。 毕赤酵母表达宿主菌主要有三种，最常用的菌株是 含有 因，可在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长，根据表达质粒整合入酵母的方式不同，重组子表型又可分为生长快型 （ 和生长慢型 （ ； 菌株 面包酵母 （ 替，宿主菌只有依赖 因合成醇氧化酶在含甲醇的培养基上生长，因此生长缓慢，表型为 ， 2000） ；还有一种宿主菌为 主的两个醇氧化酶基因都被去除，因此在甲醇为碳源的培养基上不能生长，表型为 ， 1997） 。有些分泌性表达的蛋白质因对酵母自身分泌的蛋白酶敏感而被降解，因而又产生了蛋白酶基因缺陷型的酵母菌株，如 因编码蛋白酶 A，蛋白酶 A 又可激活蛋白酶 B 和羧肽酶 Y， 因编码蛋白酶 B，因此 除了蛋白酶A 和羧肽酶 Y 的活性，部分降低了蛋白酶 B 的活性，而 去除了蛋白酶 B 的活性，完全去除了以上三种蛋白酶的活性。它们为表达外源蛋白提供了一个低蛋白酶的环中国农业科学院博士学位论文 第一部分第一章 绪论 2境，避免目标蛋白在毕赤酵母的诱导表达过程中被降解，因而具有广泛应用价值（ ，1997） 。 母表达载体 毕赤酵母细胞内没有稳定的附加质粒，表达外源蛋白主要是通过将整合型质粒 合到酵母细胞的基因组中 (欧阳立明等， 2000)来实现。整合型质粒的主要元件包括：启动子、信号肽、多克隆位点、终止子、抗性选择标志以及诱发 组的同源序列等。载体转入酵母细胞主要以插入或置换两种方式进行。 含有 动子序列的载体既可以在酵母基因组中的 点也可 点产生单交换，从而插入到酵母基因组中；也可以发生双交换，取代 因进入酵母基因组中。单交换和双交换产生的表型分别为 论以哪种方式整合入酵母基因组中，外源基因都可以单拷贝或多拷贝的方式存在。 动子 启动子是基因表达的关键元件，直接关系到基因的表达水平。目前应用最多的为 动子。 一个极强的启动子（ ， 1989） ，受甲醇的严格调控，在非甲醇的碳源条件下，检测不到 存在，而受甲醇诱导后， 达酵母可溶性蛋白的 30%（ ，1980） 。在 控下，外源基因的表达可通过调节甲醇浓度而控制表达过程，这样可以有效减轻选择压力，从而保证外源基因的稳定存在。 3动子是 可以在发酵过程中连续表达，无需诱导（ 1997） 。它可以利用葡萄糖、甲醇、甘油等多种碳源表达外源蛋白。研究发现，人壳多糖蛋白基因在 调控下，可以连续发酵 1 个月，表达量稳定在 300（ 2001） 。肾转肽蛋白在 调控下，表达量是 制下的 5 倍（ 1998） 。因此， 望成为 一个有效的替代物。利用 达外源基因的关键因素是要表达的外源蛋白不能对宿主细胞产生毒害，否则在表达过程中会影响酵母的生长从而降低蛋白表达量（ 2001） 。 人还从毕赤酵母中克隆得到了甲醛脱氢酶基因（ 动子，能以甲醇为唯一碳源或甲胺为唯一氮源情况下表达外源蛋白， 也是一个强有力的启动子 （ ， 1998， 2004） 。 号肽 酵母表达常用的信号肽是来酿酒酵母的交配因子（ ，它可以将表达的外源蛋白分泌到胞外（ 1991） 。分泌表达具有很多明显的优点，许多蛋白的正确折叠和翻译后加工都是在分泌途中完成的，因此酵母表达体系表达的真核蛋白可以经过一系列的加工而具有生物活性。分泌到胞外还使蛋白很容易纯化，使蛋白表达体系更具实用性。 择标记 中国农业科学院博士学位论文 第一部分第一章 绪论 3如何快速高效地筛选阳性转化重组子菌株是表达载体构建时必需考虑的重要因素。在毕赤酵母表达系统中，常用的选择标记是针对宿主菌营养缺陷的野生型组氨酸脱氢酶基因（ 。只有转化了含 表达载体的克隆才能在组氨酸缺陷的选择培养基上生长。但研究表明，能在选择性培养基中生长的克隆并不一定含有目的基因，因为在 化子中，约有 10%50%不含表达载体的其它成分，这是载体上的 因与酵母基因组中的 点发生重组并导致回复突变所致。利用电击法转化时，该比例更高。酵母表达载体中，还可引入抗性标记用来筛选转化子中多拷贝克隆。在毕赤酵母转化子中，多拷贝的整合率约占到 1%10%，通过在载体上引入卡那霉素抗性基因或博莱霉素基因，而使转化子产生对 抗性，通过抗性的高低来筛选多拷贝的转化子（ ， 1992； ， 1992； ， 1994； ， 2000） 。 高外源蛋白表达量的策略 母偏爱密码子的使用 毕赤酵母表达体系虽然表现出了简便和高效的特点，但仍有些外源蛋白基因在毕赤酵母中表达量很低或不表达，原因至今尚未完全阐明。可能和使用了酵母中稀有的密码子有关。低频密码子的使用会限制蛋白的表达（辛利等， 2001） 。在不改变氨基酸组成的前提下，将编码外源蛋白基因的密码子优化为酵母所偏爱密码子，有可能会提高外源蛋白的表达量（ ， 2001） ；还有将外源基因中的个别酵母稀有密码子改造为酵母高频使用的密码子来提高表达量，如在毕赤酵母中表达植酸酶时，把在酵母中使用频率为零的精氨酸密码子突变为使用频率较高的密码子，使植酸酶的表达量提高了了 37 倍（姚斌等， 1998） 。 酵条件优化 毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏好，在适宜的条件下，可在极高的培养密度下维持外源蛋白的高水平表达，因而更利于工业大规模生产。利用发酵罐培养，可有效监控培养基的 气量、碳源浓度，并能及时排出代谢产物，维持表达产物的稳定。所以，优化发酵条件，充分发挥大规模高密度发酵的优势，能增大外源蛋白表达量（ ， 2007； ， 2004） ，甚至在某些情况下，外源蛋白的表达量达到每升克级以上的水平（ ， 1991； ， 2003； ，2003） 。 选高拷贝转化子 通常情况下，转化子中所含表达盒的拷贝数越多，外源蛋白的表达水平就越高。为了充分发挥酵母转化子的表达潜力，可以筛选多拷贝的转化子，使外源蛋白基因得到高表达。有研究显示，中国农业科学院博士学位论文 第一部分第一章 绪论 4在 18 整合拷贝数的范围内，乙肝表面抗原（ 表达量随拷贝数的增加而增高（ 1994） 。筛选多拷贝转化子的方法有多种：专门为外源基因多拷贝插入酵母基因组而设计的载体 这种载体能使外源基因表达盒在体外头尾相互串连在一起,然后一起整合入酵母基因组中；使用具有卡那霉素选择标记的载体，如 使酵母具有 物抗性，插入的拷贝数越多， 抗性越强， 因此， 在高浓度 平板上能筛选到高拷贝的转化子 （ 2000） ；使用具有 因的载体，转化子具有 性，同 选机理一样，抗性越强，拷贝数越多。 低外源蛋白发生降解的几率 为了外源蛋白基因能够在酵母表达系统中得到有效表达，降低外源蛋白在表达过程中的降解是一个需要考虑的问题。外源蛋白在诱导表达过程中发生降解现象，一方面降低了表达量，另一方面还给目的蛋白的纯化带来了难度。为了避免外源蛋白降解的产生，可以采取以下三种措施：在培养基中添加富含氨基酸的物质，如蛋白胨、酵母提取物等，以增加蛋白酶作用的底物而减少目的蛋白的降解；调节培养基的 赤酵母可以在 范围内正常生长，通过 以改变酶的活性，从而减少蛋白的降解 (， 1991)；选用蛋白酶缺陷型菌株，如使用 （ 1998） ；降低诱导表达时的培养温度，如 人通过将诱导表达时的温度从 30降到 25， 而使半乳糖氧化酶的表达量提高了 4 倍 （ 2000） 。 肠杆菌表达体系的研究进展 自 20世纪 70年代以来，大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统之一。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞，但大肠杆菌作为一种遗传背景比较清楚、遗传物质相对简单的原核生物，在基因表达领域仍有着它独特的优势。用大肠杆菌作为宿主表达外源蛋白，易对基因进行表达调控，而且大肠杆菌易于培养，生成的外源蛋白通常以包涵体的形式存在，可以获得高产量的目的蛋白，且易于纯化。因此，大肠杆菌外源基因表达系统在生产基因工程疫苗、抗体、药用蛋白和工具酶等方面发挥着关键作用。 用大肠杆菌表达外源蛋白的原理是宿主菌在生长过程中， 产生的阻遏蛋白， 与 纵基因结合后阻碍外源性基因的转录和表达，当宿主菌生长到对数时间时，向培养基中加入诱导物如异丙基硫代 导外源基因开始进行大量的转录并高效表达。 在基因工程研究领域， 大肠杆菌一直是基因表达的重要工具， 尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，对大肠杆菌宿主细胞也做了许多改造工作。 中国农业科学院博士学位论文 第一部分第一章 绪论 合表达 用大肠杆菌表达外源蛋白时，为了提高蛋白产物的活性和方便下游纯化等，通常在表达载体中插入一些辅助基因序列与目的基因构成融合蛋白表达， 例如： 插入融合信号。 如 以使融合蛋白通过经典的 利于形