【毕业学位论文】（Word原稿）苏云金芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢旁路相关基因簇的结构与功能研究生物化学与分子生物学博士论文

密级 :无 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 苏云金芽胞杆菌 相关基因簇的结构与功能研究 F 摘 要 苏云金芽胞杆菌（ 称 其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为 农业生物防治上 应用最为广泛的杀虫微生物。 其它芽胞杆菌相比，一个显著特 点就是在形成芽胞的同时，还能产生由杀虫蛋白组成的伴胞晶体。有关 胞 晶体形成机制方面的研究主要是集中在杀虫晶体蛋白基因的表达调控 上 ，而从代谢调控的角度研究晶体 蛋白 形成的分子机制目前尚 未 见 报道 。本论文围绕苏云金芽胞杆菌 中与 关基因 簇 的 结构和功能 进行了 一系列的研究，主要内容包括： 本研究从国内分离得到的苏云金芽胞杆菌 因 ，并 分别在大肠杆菌中进行了表达和纯化。酶活测定 结果表明， 氨基酸序列同源性比对分析发现，这两个蛋白质在蜡样芽胞杆菌 群 （ B. 中具有较高的相似性，而与枯草芽胞杆菌的相似性 较低， 分别为 58%、 51%。 利用基因敲除技术分别构建了 株的 因缺失突变株，同时也构建了相应的回复突变株，对 因的功能进行了研究，结果表明： 因敲除不会影响突变株在丰富培养基中的正常生长，但在基础培养基（含 因缺失突变株的生长会受到抑制； 因敲除对晶体 蛋 白 的 表达量无显著 影响，但 体 蛋白 的 表达 ； 因敲除 均 会导致 芽胞 产 量 的降低 。 通过对 株 因簇的克隆及序列分析发现， 因簇的 结构 与大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的 明显 不同，而在 蜡样芽胞杆菌群 中基本上是一致的，说明 结构 在 蜡样芽胞杆菌群 中 是比较 保守 的。通过 录分析发现 中 独转录 ，而 其上游的转录激活因子编码基因 根据克隆并测序的 因簇序列， 分别克隆了 因的启动子，并构建了相应的 合表达载体。通过 苷 酶活性的定性和定量分析，表明 因 的转录 都 是由 自身的启动子 调控的 。 以上研究 结果 表明 因 属于不同的转录单元 ，而 因组成了一个操纵子 。 利用 敲除 载体 源重组方法敲除 变 株 发现突变菌株的生长、产芽胞和晶体 蛋白 的能力与出发菌株相比并无明显差异。但 因的缺失严重地影响了 活性，并通过其回复突变株恢复了 活性，说明 因对因 的表达起正调控作用。 同样地，发现 因对 因 的表达 也 起正调控作用 。通过对 因的表达产物 白 的结构域分析， 推测 它可能是一种依赖于 54 因子的激活蛋白，在 蜡样芽胞杆菌群 中 比较 保守，有关其调控作用需进一步的验证。 总之， 本研究为深入研究苏云金芽 胞 杆菌 为进一步研究芽胞和伴胞晶体形成机制提供了线索。 关键词 ：苏云金芽胞杆菌 ， 杀虫晶体蛋白 ， 琥珀酸半醛脱 氢酶 ， 因簇 ， 基因 表达调控 as Bt is on of of in is In of t We . 03 . by By of in . 03 . 68 8% 1%, To of t by of of of in of in of of in in of t is . . is . by It is . in We of by to an of of in in in a in to by a 54to it is . by in to be In a be to to of . 中国农业科学院博士学位论文 目录 目 录 绪 论 . 1 1 虫晶体蛋白 . 1 态描述 . 1 理生化机制 . 2 子生物学研究 . 3 2 芽胞杆菌 . 7 . 8 . 9 . 9 . 10 谢途径的生理功能 . 11 3 微生物功能基因组学的研究内容与方法 . 12 能基因组学的主要研究内容 . 12 因功 能的研究方法 . 13 4 本研究的立题依据 . 21 5 本研究的目的和意义 . 21 第一章 关基因的克隆、表达及 同源性分析 . 22 1 材料与方法 . 22 验材料 . 22 究方法 . 26 2 结果与分析 . 34 珀酸半醛脱氢酶 因的鉴定 . 34 珀酸半醛脱氢酶的表达与纯化 . 34 珀酸半醛脱氢酶的活性检测 . 36 基酸序列同源性分析 . 38 3 讨论 . 39 4 小结 . 41 第二章 因缺失突变株的筛选及鉴定 . 42 1 材料与方法 . 42 验材料 . 42 究方法 . 44 2 结果与分析 . 51 2.1 因缺失突变菌株的构建与鉴定 . 51 中国农业科学院博士学位论文 目录 2.2 因缺失突变菌株的构建与鉴定 . 55 2.3 因回复 突变株 的构建与筛选 . 57 发菌株、突变株和回复菌株的生长特性比较 . 58 变株对晶体蛋白表达的影响 . 58 变株对芽胞形成的影响 . 61 3 讨论 . 61 t 晶体蛋白的提 取 . 61 用 法测定 体蛋白的含量 . 62 4 小结 . 62 第三章 操纵子的鉴定 . 63 1 材料和方法 . 63 验材料 . 63 究方法 . 64 2 结果与分析 . 69 2.1 克隆与序列分析 . 69 2.2 析 . 69 2.3 启动子鉴定与融合表达 分析 . 70 3 讨论 . 74 . 74 动子的识别与克隆方法 . 74 4 小结 . 75 第四章 因缺失对 因表达调控的影响 . 76 1 材料和方法 . 76 验材料 . 76 究方法 . 77 2 结果与分析 . 78 白质的结构及序列同源性分析 . 78 除载体 构建与鉴定 . 82 2.3 因缺失突变株的筛选与鉴定 . 84 变株 功能恢复 . 85 变株的生长特性 . 85 变株产芽胞和晶体能力的分析 . 86 2.7 因缺失突变对 活的影响 . 87 3 讨论 . 88 胞杆菌中的 54 因子 . 88 录激活因子的调控作用 . 88 中国农业科学院博士学位论文 目录 4 小结 . 89 第五章 结 论 . 90 参考文献 . 91 致 谢 . 105 作者简历 . 107 中国农业科学院博士学位论文 插图与附表 插图和附表 绪 论 图 1 苏云金芽胞杆菌中的芽胞和晶体 1 图 2 意图 8 图 3 枯草芽胞杆菌中 因簇的组织结构 10 图 4 苏云金芽胞杆菌 7株 因簇的结构 示意图 10 图 5 B. B. B. 株亲源关系遗传进化树 15 图 6 同源重组双交换原理示意图 18 图 7 联系 制与染色体动力学之间的蛋白质互作网络示意图 20 第一章 表 1菌株和质粒 23 表 1因扩增引物序列 27 表 1 白 酶活测定结果 38 图 1因 增结果 34 图 1重组表达载体 建流程图 35 图 1重组表达载体 切鉴定结果 35 图 1合蛋白镍柱亲和层析纯化 泳图 36 图 1重组表达载体 建流程图 37 图 1重组表达载体 切鉴定结果 37 图 1合蛋白谷胱 苷 肽琼脂糖亲和层析纯化 泳图 38 图 1芽胞杆菌 属中 A） 和琥珀酸半醛脱氢酶 （ B） 系统进化 分析 39 第二章 表 2菌株和质粒 43 表 2引物序列表 45 表 2出发 菌株、突变菌株、回复菌株活芽胞记数差异显著性分析 61 图 2敲除载体 建 流程图 46 图 2因敲除过程示意图 47 图 2回复载体 建 流程图 51 图 2敲除载体 酶切及 测 53 图 2失突变菌株的 选结果 54 图 2失突变菌株的 定结果 54 图 2因突变株 因组 析 54 图 2敲除载体 酶切及 测 56 中国农业科学院博士学位论文 插图与附表 图 2失突变菌株的 定结果 57 图 2因突变株 因组 析 57 图 2复载体 酶切鉴定及 测 58 图 2复 突变 转化子 58 图 2发 菌株 、 突变菌株和回复菌株生长曲线比较 59 图 2发 菌株与突变菌株不同时期晶体蛋白 表达 的比较 59 图 2发 菌株 、 突变菌株和回复菌株 表达 体蛋白的 测结果 60 第三章 表 3菌株 与质粒 63 表 3引物序列表 65 表 3株 列注释结果 69 图 3重组质粒 构建流程图 68 图 3株 因簇的 增结果 68 图 3株 因簇的结构示意图 70 图 3因转录 果 70 图 3因转录 果 70 图