基因工程的主要技术与原理-核酸分离 电泳ppt课件

生物技术专业核心课程,基因工程,F基因的化学合成,D分子杂交技术,A核酸的分离和纯化,B核酸电泳,3.基因工程的主要技术及原理,CPCR技术,EDNA核苷酸序列分析,.,第一节核酸的分离和纯化,一、DNA的分离、检测和纯化,DNA的来源及用途,染色体DNA:分子巨大，1000Kb-106Kb。是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料；也可用于构建染色体载体和染色体基因整合平台。,(IsolationandPurificationofnucleicacid),.,染色体DNA比较,.,细胞器DNA:主要指线粒体DNA和叶绿体DNA,是真核生物所特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸作用和光合作用相关的基因。可用于分离目的基因和构建克隆载体。,叶绿体DNA比较,.,线粒体DNA比较,.,病毒和噬菌体DNA:主要用于构建基因克隆载体，可承载较大片段的外源DNA。,质粒DNA:为染色体外遗传物质；分子大小1Kb-几百Kb不等，具有复制起始位点，可自我复制。主要用于构建基因克隆载体。,.,DNA提取的一般程序,供体细胞培养,收集(菌体)细胞,细胞破碎,分离总DNA,细胞器DNA的分离、纯化,总DNA的抽提、纯化,分离细胞器,.,1.化学法：,细胞裂解方法,酶解:利用酶在温和的条件下，有选择性地破坏细胞膜系统。溶菌酶、溶壁酶、纤维素酶、果胶酶等。,2)增溶：利用表面活性剂的增溶作用破坏细胞膜系统。常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。,.,2.机械法：,1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌2)匀浆法：搅切器(blender)，混合器(mixer)，3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末4)超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行细胞破碎，效率更高,.,3.其它方法：,1)煮沸法：2)冻融法：3)干燥法：,.,植物总DNA的提取,一般地说，总DNA主要是指基因组DNA(genomicDNA),即细胞核内的染色体DNA分子。,核DNA分子呈极不对称的线状结构,一条染色体为一个DNA分子。高等植物核DNA大约含有109bp，其长度与直径的比例极不对称，使其对机械力十分敏感。很难分离出它的完整分子。分离纯化过程中，DNA分子的断裂是很难避免的。,.,为了尽可能获得大分子量的DNA，一般采用去污剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。,植物总的提取方法从提取原理上主要有以下两种：,对于基因组文库的构建及Southern杂交，应尽量使用片段较长的DNA分子。,CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)SDS法(十二烷基磺酸钠),.,1.CTAB法原理,CTAB,高盐溶液(0.7mol/LNaCl),CTAB,CTAB,CTAB,核酸,蛋白质,多糖,低盐溶液(0.3mol/LNaCl),上清液,沉淀,CTAB,核酸,CTAB,核酸,核酸,核酸,核酸,核酸,乙醇或异丙醇溶液,核酸,上清液,沉淀,.,CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物；,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。,在高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同白质、多糖类物质分开；,1.CTAB法原理,.,2.SDS法原理,其原理是利用高浓度的SDS（十二烷基硫酸钠在较高温度（55-650C）条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸；,在低温、高盐条件下，使蛋白质及多糖沉淀(常是加入5mol/L的乙酸钾冰浴，使乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物)。,离心除去沉淀后。上清液中的DNA进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的DNA。,.,SDS法操作简单、温和，也可提取到高分子量的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。,CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先使用。,3.CTAB与SDS,.,4.基因组总DNA法提取程序,1)液氮研磨材料成粉末，置于离心管中再加入适量2CTAB提取液，充分混匀，65水浴1hr；,2)4，12000r/m，离心10min，吸取上清液转入新的离心管；,3)加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，静置5min后于4、12000r/min，离心10min；,裂解细胞膜,沉淀材料残渣,变性、沉淀蛋白质,.,5)将上清液转入另一离心管，加入等体积异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰浴20-30min，沉淀DNA；,6)挑出絮状DNA沉淀，70%乙醇中洗涤2次；,7)无水乙醇洗涤1次；,8)风干后，加适量TE缓冲液或无菌双蒸水溶解DNA，-20贮存备用。,4)将上清液转入另一离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，4、12000r/min，离心10min；,进一步变性、沉淀蛋白质，清除残余苯酚,沉淀DNA,洗涤、干燥DNA,溶解、保存,.,DNA电泳结果,.,大肠杆菌质粒DNA的提取,克隆载体分子及装载于载体中的克隆化基因，大多是以质粒的形式保存在大肠杆菌中，因此，许多基因操作都离不开大肠杆菌质粒DNA的提取，其步骤主要有3个：,细菌的培养细菌的收集和裂解质粒DNA的分离和纯化,.,碱裂解法提取E.coli质粒DNA程序及原理,1.将菌落转接入约5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37恒温振摇，培养过夜(12hr)；,2.取1.5ml培养物转入微量离心管中，4，12000r/min离心30sec，倒掉培养液，尽可能清除残余液(可重复2-3次)；,3.弃培养液，使细菌尽可能干燥；,细菌的培养,菌体的收集,.,4.将细菌沉淀重悬于200l冰预冷的溶液I中，剧烈振荡；,5.加入400l新配置的溶液II，快速颠倒离心管数次，混匀后，将离心管置于冰上3-5min；,溶液I：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；,悬浮菌体,溶液II：0.2NNaOH/1%SDS；,裂解菌体细胞,充分悬浮，避免结块。,控制时间；,操作柔和。,.,6.加入300l冰预冷的溶液III，后温和振荡10秒钟，混匀后，置于冰上3-5min；,溶液III：3M醋酸钾/2M醋酸,质粒DNA的分离,中和NaOH；,沉淀蛋白质和基因组DNA。,7.4，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中；8.加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，4，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中；9.加入等体积的氯仿混匀，4，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中；,进一步变性、沉淀蛋白质,.,14.风干后，溶于20-50lTE缓冲液或无菌双蒸水中；15.加入适量无DNA酶的RNase(20g/ml)，37处理30min；16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20贮存备用。,沉淀、洗涤DNA,也可用等体积异丙醇沉淀质粒DNA；,10.加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，置于冰上沉淀DNA；11.4，12000r/min离心15min；12.小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出；13.70%乙醇洗涤DNA沉淀；,溶解备用,消化RNA,适度干燥；,.,质粒DNA电泳结果,1.共价闭合环状超螺旋(covalentlyclosedcircularDNA,ccc-DNA),超螺旋,线状分子,3.开环螺旋(opencircularDNA,oc-DNA),2.线状DNA(linearDNA,l-DNA),开环螺旋,.,二、RNA的分离和纯化,一个典型的哺乳动物细胞约含10-5ugRNA，其中，80-85%为rRNA(28S、18S和5S三种)；其余15-20%为各种低相对分子量RNA，如tRNA、核内小分子RNA等，而mRNA只占1-5%。,mRNA是单链的，极易受到核酸酶的攻击而导致降解。对RNA的操作要求比DNA更为严格。,.,（一）控制潜在的RNA酶活性,2)解决办法：,1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(0-65均具活性)；抗变性剂。,湿热灭菌：一次性用品，如微量移液吸头(tip)、微量离心管(eppendorftube)等，先用0.1%的焦磷酸二乙酯(DEPC)处理过的水浸泡过夜后，121湿热灭菌30min;,干热灭菌：耐热器皿，如玻璃制品、研钵、镊子等，可在180-200高温干热灭菌4hr以上；,.,电泳用具：最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用3%H2O2和0.1%的DEPC水浸泡后，冲洗干净方可使用。,操作者防护：实验过程中必须带手套，并常换手套，尽量避免外源RNase的污染；,内源RNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。,.,（二）RNA的抽提和纯化,1)酚-异硫氰酸胍抽提法：,异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制RNase活性；,GIT与十二烷基肌氨酸钠共同作用可使蛋白质变性，从而释放RNA；,在酸性条件下，DNA极少发生解离，而是同蛋白质一起沉淀，RNA则保留在上清液中而得到分离；,.,2)硅胶膜纯化法：,RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与DNA纯化思路相似；,当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开；,在低盐浓度条件下，RNA被洗脱液洗脱下来；,.,（三）mRNA的纯化,Northern杂交可以使用总RNA,而构建cDNA文库时，则必须得到纯化的mRNA；,亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3端的poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开发出许多用于mRNA纯化的层析柱。,.,RNA电泳结果,28SrRNA,18SrRNA,.,三、核酸的评价,1.核酸纯度评价：,DNA样品：OD260/OD280=1.8较纯；OD260/OD2801.8可能有RNA污染；OD260/OD2802.0可能有异硫氰酸残存；OD260/OD2801.7有蛋白质或酚污染,.,2.核酸浓度估算：,当OD2601时，SSDNA=37g/mldSDNA=50g/mlSSRNA=40g/ml寡核苷酸浓度约为30g/ml,.,(NucleicAcidGelElectrophoresis),第二节核酸的凝胶电泳,.,优点：（1）便于分离；（2）便于检测；（3）便于回收。,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；,电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。,.,一、核酸凝胶电泳的基本原理,核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；,因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。,电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；,.,一、琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis,检测DNA是否真的存在，是否有降解现象，DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟的检测DNA的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物，在0.7%的琼脂糖浓度下，对0.8-10kb的DNA有最佳的分离效果。,.,（一）凝胶的制备及电泳,琼脂糖分子式,琼脂糖(Agarose)：是从红色海藻中提取的一种线状多糖高聚体。,.,琼脂糖凝胶制作过程,.,.,.,.,（二）DNA的迁移速率决定因素,双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；,同一分子：超螺旋环状线状缺口环状。,1.DNA分子的大小和构象,.,2.琼脂糖浓度和种类,浓度越低，相同核酸分子迁移越快；,常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,5000,.,不同类型琼脂糖的性质,.,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,.,3.凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。,5.所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比；,6.电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBE。,.,.,TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较,1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。,.,（三）凝胶载样缓冲液,载样缓冲液：在上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。,载样缓冲液有三个作用：,增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；可以指示电泳进程。,.,6凝胶载样缓冲液,.,指示剂:,溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同。在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。,二甲苯腈的水溶液呈兰色，携带的电荷量比溴酚兰少，迁移的速度比溴酚兰慢，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。,.,（四）琼脂糖凝胶中DNA的检测,通过染色,紫外灯下检测。,主要染料：溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）SYBRGold,.,1.凝胶的EB染色,EB的分子式,.,EB的染色原理,溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间,.,使用EB染色注意事项,（1）EB被认为是一种强致癌物质,（2）EB可用来检测单链或双链核酸,（3）EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5g/ml。,（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,.,2凝胶SYBRGold的染色,SYBRGold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。,.,（五）凝胶中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,.,GelDoc2000SystemsandAccessories,.,（六）凝胶中DNA的回收,现一般采用试剂盒回收。,存在的主要问题：,不能有效的回收大片段DNA不能有效回收少量DNA,.,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE,.,在四甲基乙二胺(TEMED)催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。,（一）聚丙烯酰胺凝胶的本质,在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。,网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,.,CH2=CH-C(O)-NH2(丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2（N，N-亚甲双丙烯酰胺）,.,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1.变性聚丙烯酰胺凝胶,用于单链DNA片段的分离或纯化、DNA测序反应等。,变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关，只与分子大小有关。,.,2.非变性聚丙烯酰胺凝胶,迁移率受其碱基组成和序列的影响。,用于双链DNA片段的分离和纯化、制备高纯度的DNA片段。,.,（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯