辣根过氧化物酶PPT课件

第三节酶标记物的制备,.,2,一、酶制剂及其底物,作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)活性高(2)性质稳定(3)专一性强(4)酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5)方法敏感，重复性好，简单易行(6)酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。,.,3,辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP),HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH39,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。,.,4,HRP酶促反应,酶促反应的过程：HRPDH2H2O2D2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外，还有一种供氢体称ABTS2,2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)，灵敏度和稳定性均好。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。,.,5,HRP常用底物,.,6,碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)，,AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。小牛肠粘膜AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；大肠杆菌AP分子量为80kDa，最适pH为8.0。AP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。,.,7,AP常用底物,.,8,作为酶标记对象的抗原与抗体要求：,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,.,9,制备方法要求：（1）技术方法简单、产率高，重复性好；（2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；（3）酶标记物稳定，不形成聚合物。,.,10,二、酶结合物的制备方法,.,11,（一）过碘酸盐氧化法,原理：是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己糖邻位-0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗体蛋白中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的HRP-IgG偶联物。所获酶标记抗体的产率高，将近70的HRP和IgG结合，99的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。,.,12,1、HRP标记腹水单抗,过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗1、5mgHRP溶解于0.5ml0.1MNaHCO3中；2、加0.5ml10mMNaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h；3、加0.75ml0.1MNa2CO3，混匀；4、加0.75ml小鼠腹水单抗，混匀；5、加SephadexG25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h；6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中；7、用少许PBS将交联物全部洗出；8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30min；9、再加3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1h；,.,13,10、将交联物过SephdexG200（2.6100cm）层析纯化，分管收集第一峰。,Fig2-1.GelfiltrationofthereactionmixtureofHRPconjugatedtomAb13A4onaSephadexG200column（2.6cm100cm）,equilibratedwithPBS,atarateof0.15ml/minandatube/15min.,.,14,2、HRP标记多抗,1.称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。2.于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。3.将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。4.加20l0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mgIgG在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2h。5.加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置42h。,.,15,6.将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4过夜。7.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41h。8.3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。9.将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物。,.,16,（二）戊二醛交联法,原理：戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。,.,17,HRP标记多抗,1、取10mgHRP溶于0.2mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20左右）反应结合18h。2、用0.15mol/LNaCl平衡过的SephadexG-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4透析过夜。3、将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/LNaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。,.,18,4、加入0.1mL1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.09.6），4，电磁搅拌下结合24h。5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。6、装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2PBS，4透析过夜，或通过SephadexG-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液。本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点：酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。,.,19,注意事项,1、标记用HRP的RZ值应3.0;2、所使用试剂的pH和浓度及用量必须严格掌握；一般HRP:待标记物2:1到4:1之间。；所用试剂，如过碘酸钠氧化法中的NaIO和NaBH、戊二醛标记法中的戊二醛必需新鲜配制；3、室温搅拌时须避光，室内温度一般在25为宜；4、标记抗体的酶IgG克分子比应介于12之间；5、浓的标记物相当稳定，常加入3050%甘油于-10以下保存。4可保存12年，但稀释成110，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。,第四节酶免疫测定技术要点,一、基本概念,酶联免疫吸附试验（ELISA）：结合在固相载体上的抗原（抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后，催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测抗原（抗体）含量成正比。包被（coating）：指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物理吸附作用，一般靠疏水键连接。封闭（blocking）：指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残留的未饱和位吸附位点的过程。免疫吸附剂（immunosorbent）：固相化的抗原或抗体。,加样：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。温育：常采用的温度：43、37、室温和4（冰箱温度）。洗涤：是ELISA最主要的关键技术，目的是分离游离的和结合的酶标记物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。显色：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸终止；TMB显色终止液：叠氮钠、SDS、各类酸性终止液。比色：以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。,ELISA操作要点：,.,24,标记抗体质量判定,（1）定性及效价滴定：,双向琼脂扩散试验测HRP-IgG效价,双向免疫扩散效价最低116,直接ELISA法测HRP-IgG效价,直接ELISA效价110000以上,采用直接ELISA法测定酶标单抗效价，以特异显色为1.0时的稀释倍数作为酶标单抗效价。,.,26,标记抗体质量判定,（2）定量和克分子比值测定：分光光度计测定(光程1cm)酶量(mg/ml)OD403nm0.4IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm0.3)0.62(过碘酸盐)IgG量(mg/ml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62(戊二醛)酶量(mg/ml)IgG量(mg/ml)酶量HRP/IgG(摩尔比)440,000160,000IgG量标记率=OD403nm/OD280nm,.,27,用于ELISA酶标抗体的各项指标参数,.,28,表2单抗12H7-HRP标记物性质,.,29,三、包被抗体工作浓度确定,包被液稀释单抗15F3为1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:5000和1:7500包被酶标板;向酶标板中加入rhPI（1000ng/ml）;然后加入经稀释的酶标抗体HRP-13A4进行测定。以P/N值最大，且N值0.1时包被抗体稀释度作为单抗15F3最适工作浓度。,.,30,Table2-2.TheworkingconcentrationformAb15F3tocoattheELISAplates.(n=3),aP:absorbanceofthepositive;N:absorbanceoftheblank.,.,31,四、酶标抗体工作浓度确定,取rhPI（1000ng/ml）加入最适工作浓度15F3包被的酶标板中；然后加入1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700和1:800系列稀释的酶标抗体HRP-13A4进行测定；以P值为1.0时酶标抗体稀释度作为HRP-13A4最适工作浓度。,阳性吸光值达1.0以上，阴性对照吸光值低于0.1时，酶标抗体最大稀释度为1500。因此，酶标抗体HRP-13A4的工作浓度为1500。,Fig2-2.ElectingtheoptimaldilutestrengthofHRP-labeledantibody13A4forthecaptureELISA.Theexperimentwascarriedoutintriplicateandthecurverepresentsthe