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1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法,1,.,相关参考性标准、文件,GB19489-2008生物安全通用要求病原微生物实验室生物安全管理条例-2004年国务院令第424号人间传染的病原微生物名录2006年检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明CNAS-CL09-2014GB4789.282013食品微生物学检验培养基和实际的质量要求食品微生物实验室菌种保藏方法SN/T2660-2010消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995生物安全实验室建筑技术规范GB50346-2011,2,病原微生物分类,第一类病原微生物是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类病原微生物是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。,3,病原微生物分类,第三类病原微生物是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。第四类病原微生物是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。,4,病原微生物分类,药典涉及的微生物：29.蜡样芽胞杆菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-269.肠杆菌属，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-273.致病性大肠埃希菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-284.肺炎克雷伯菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2,5,病原微生物分类,126.铜绿假单胞菌，危害程度分类第三类活菌操作：BSL-2，132.甲、乙、丙型副伤寒沙门菌，危害程度分类第三类活菌操作：BSL-2133伤寒沙门菌，危害程度分类第三类活菌操作：BSL-2,6,病原微生物分类,141.念珠状链杆菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2142.肺炎链球菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2143.化脓链球菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2144.链球菌属，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2,7,病原微生物分类,137.粘质沙雷菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2138.志贺菌属，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2139.金黄色葡萄球菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2140.表皮葡萄球菌，危害程度分类第三类活菌操作实验室：BSL-2,8,1106：控制菌检查法,目的：检查供试品中是否存在特定的微生物结果判断：非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准方法：可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法具有抗菌活性的样品：供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和,9,1106：控制菌检查法,使用中和剂或灭活剂：应确认有效性及对微生物无毒性培养基：培养基应进行适用性检查。控制菌检查方法：应进行方法适用性试验，目的：以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。,10,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查菌种金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003铜绿假单胞菌CMCC（B）10104大肠埃希菌CMCC（B）44102乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094白色念珠菌CMCC（F）98001生孢梭菌CMCC（B）64941,11,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查菌液制备略把最复杂的事情简单化可以使用标准菌株可以逐步稀释计数,12,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性（1）肠道菌增菌液体培养基检查耐胆盐革兰阴性菌促生长能力的实验菌株：大肠埃希菌铜绿假单胞菌结果：应生长良好（生长特性）抑制能力实验菌株：金黄色葡萄球菌结果：不应生长（专属性）（2）紫红胆盐葡萄糖琼脂检查耐胆盐革兰阴性菌促生长能力+指示特性实验菌株：大肠埃希菌铜绿假单胞菌,13,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查(3)麦康凯液体培养基促生长能力:大肠埃希菌抑制能力:金黄色葡萄球菌(4)麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示特性:大肠埃希菌(5)RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力:乙型副伤寒沙门菌抑制能力:金黄色葡萄球菌,14,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查(6)木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力+指示特性:乙型副伤寒沙门菌(7)三糖铁琼脂培养基指示能力:乙型副伤寒沙门菌(8)溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基促生长能力:铜绿假单胞菌菌抑制能力:大肠埃希菌,15,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查(9)甘露醇氯化钠琼脂培养基促生长能力+指示特性:金黄色葡萄球菌抑制能力：大肠埃希菌(10)梭菌增菌培养基促生长能力:生孢梭菌(11)哥伦比亚琼脂培养基促生长能力:生孢梭菌,16,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查(12)沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力白色念珠菌(13)沙氏葡萄糖琼脂培养基促生长能力+指示特性白色念珠菌(14)白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌,17,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查接种及判断（1）液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好（2）固体培养基促生长能力检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验于被检培养基和对照培养基平板上，在相应的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致,18,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查接种及判断（3）培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。（4）培养基指示特性检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌，于被检培养基和对照培养基平板上，在相应培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。,19,1106：控制菌检查法,培养基适用性检查总结(1)培养基的营养特性（2）培养基的特殊选择性（3）培养基的指示剂的特殊标记能力（4）可使用标准菌株（5）与对照培养基比较（6）对于无法提供对照培养基时，应参考培养基性能检测报告中的生物学指标进行检查生长率和选择性,20,1106：控制菌检查法,控制菌检查方法适用性试验（1）供试液制备：略（2）试验菌：同培养基适用性检查的菌液制备,21,1106：控制菌检查法,控制菌检查方法适用性试验（3）适用性试验常规法供试液+不大于100cfu的试验菌培养基中采用薄膜过滤法：供试液过滤冲洗加试验菌在最后一次冲洗液中？加培养基培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。简称：供试品阳性,22,1106：控制菌检查法,控制菌检查方法适用性试验结果判断（1）若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；(2)若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性并重新进行方法适用性试验。（3）如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除,可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查,23,1106：控制菌检查法,控制菌检查方法适用性试验总结（1）方法适用性包括供试品制备方法（2）可供选择的方法：常规法，稀释法，薄膜过滤法尽量选择简单、可行的方法。（3）方法适用性的选择与建立应结合药品成分进行,24,1106：控制菌检查法,供试品检查：阳性对照：供试品阳性，应长菌阴性对照：应不长菌判断：供试品检查实验的有效性,25,1106：控制菌检查法,耐胆盐革兰阴性菌是一类能够耐受胆盐的革兰氏阴性细菌，其囊括的细菌种类和范围比大肠菌群更广。有肠杆菌科、假单胞菌属和气单胞菌属。代表菌为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌。定性实验：供试液制备和预培养-使细菌充分恢复但不增殖预培养物接种至肠道菌增菌液体培养基中30-35培养24-48小时增菌液划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板,26,1106：控制菌检查法,耐胆盐革兰阴性菌结果判断-长菌或不长菌（定性）耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数类MPN法（定量）取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1mL、0.01mL和0.001mL）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌增菌液体培养基中，30-35培养24-48小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30-35培养18-24小时。,27,1106：控制菌检查法,耐胆盐革兰阴性菌预培养管1预培养管2预培养管3肠道增菌液管1肠道增菌液管2肠道增管菌液3紫胆平板1紫胆平板2紫胆平板3若盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。查表给出定量值,28,1106：控制菌检查法,肠道菌增菌液体培养基明胶胰酶水解物10.0g；二水合磷酸氢二钠8.0g牛胆盐20.0g；亮绿15mg；葡萄糖5.0g纯化水1000mL磷酸二氢钾2.0g除葡萄糖、亮绿外,取上述成分,混合,微温溶解，调节pH值使加热后在25的pH值为7.20.2，加入葡萄糖、亮绿，加热至10030分钟，立即冷却。,29,1106：控制菌检查法,紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基酵母浸出粉3.0g中性红30mg明胶胰酶水解物7.0g结晶紫2mg脱氧胆酸钠1.5g琼脂15.0g葡萄糖10.0g纯化水1000mL氯化钠5.0g除葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解，调节pH使加热后在25的pH值为7.40.2。加入葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸（不能在高压灭菌器中加热）。,30,1106：控制菌检查法,耐胆盐革兰阴性菌注意事项：接种量0.1g、0.01g和0.001g（或0.1mL、0.01mL和0.001mL）,结果直接查表若接种量减少10倍（如0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），则每1g(或1mL)供试品中可能的菌数（N）应相应增加10倍。含药材原粉的中药制剂：固体口服液体口服给药制剂及中药饮片,31,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌定义：属于假单胞菌属、革兰氏阴性杆菌、氧化酶阳性、产生绿脓毒素。此外还可液化明胶、还原硝酸盐为亚硝酸盐、在421能生长。对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症常见的分离鉴别试验,32,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌增菌培养：1:10样品10ml加90ml胰酪大豆胨液体培养基，361培养18-24小时分离培养：从培养液挑取培养物，化线接种与十六烷基三甲基溴化铵琼脂培养基（选择性），361培养18-24小时，菌落周围培养基略显粉色，其他菌不生长。,33,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌染色镜检：镜检为阴性杆菌者进一步实验氧化酶实验：菌落+1%二甲基对本二胺试液，观察培养物颜色，阳性为粉红色或紫红色绿脓菌素试验：菌落接种至绿脓菌素培养基上，361培养18-24小时，加氯仿，待氯仿层为蓝色时，将氯仿吸入小试管，加1mol/L盐酸1ml振摇,观察分层后上层盐酸层的颜色，阳性为粉红色或紫红色,34,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌硝酸盐还原产气实验：菌落接种入硝酸盐胨水培养基（加小导管），361培养24小时，小导管有气为阳性。明胶液化实验：挑菌落穿刺接种明胶培养基内，361培养242小时，取出放冰箱30分钟，观察表面培养基溶解情况，溶解为阳性。42生长实验：菌落接种普通营养琼脂斜面培养基，421培养24-48小时，有生长为阳性,35,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌结果报告：革兰氏阴性杆菌、氧化酶实验阳性及绿脓菌素试验阳性即可报告检出。如绿脓菌素试验阴性而明胶液化实验、硝酸盐还原产气实验、42生长实验均为阳性，仍可报告检出,36,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌反应原理：氧化酶实验:氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有红色的醌类化合物。主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。绿脓菌素实验:能代谢产生一种水溶性色素，使培养基变成绿色。为蓝绿色的吩嗪类化合物，无荧光性。另一种为荧光素，呈绿色。绿脓素只有绿脓杆菌产生，故有鉴别意义。,37,1106：控制菌检查法,38,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌检查注意事项：增菌培养可适当延长时间有疑似菌时，可与阳性对照菌一起进行确证实验不同类型的样品有时会影响增菌液色素1%二甲基对本二胺试液不稳定，以新鲜配制使用菌进一步实验，避免漏检。,39,1106：控制菌检查法,铜绿假单胞菌检查注意事项十六烷基三甲基溴化铵琼脂培养基开启后注意防潮，分离时宜加阳性菌控制培养基的适用性，避免假阴性对十六烷基三甲基溴化铵琼脂培养基上可多挑几个菌进一步实验，避免漏检。,40,1106：控制菌检查法,金黄色葡萄球菌,41,1106：控制菌检查法,金黄色葡萄球菌增菌培养取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种胰酪大豆胨液体培养基中培养18-24小时。选择和分离培养取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30-35培养18-72小时。若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验,确证是否为金黄色葡萄球菌；,42,金黄色葡萄球菌主要鉴别生化原理：血浆凝固酶实验：病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块。凝固酶试验对于判定该菌株是否具有致病力，很有帮助。葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。血浆凝固酶实验：同时设阳性对照组和阴性对照组（用表皮葡萄球菌作为阴性对照）,1106：控制菌检查法,43,1106：控制菌检查法,金黄色葡萄球菌的血浆凝固酶实验,44,1106：控制菌检查法,血浆凝固酶实验,45,1106：控制菌检查法,金黄色葡萄球菌主要鉴别生化原理：BairdParker平板：圆形、光滑、凸起、湿润，灰色至黑色，周围为一浑浊带，外层有透明带。培养基中氯化锂可以抑制革兰氏阴性细菌生长，丙酮酸钠可以刺激金黄色葡萄球菌生长，用于提高检出率血琼脂平板：金黄色、大而凸起、圆形、不透明，表面光滑、周围有溶血环血平板上菌落为金黄色，是本身含金黄色色素为类胡罗卜素，属脂溶性，不会溶于培养基中。但致病的葡萄球菌能产生溶血毒素,是溶解红细胞的外毒素，,46,1106：控制1106：控制菌检查法菌检查法,金黄色葡萄球菌主要鉴别生化原理因此血平板上的形成“溶血环”为重要的判断特征。人体分离致病株产生“热溶血素”，动物体分离的致病株经36培养后与室温或4放置过夜可增加溶血环。因此，如果溶血环不明显可增加观察时间。避免漏检对于疑似菌，反应又不完全对上的，借助仪器设备或成套试剂鉴定佐证对检出的致病菌要保存一定的时间，才可销毁,47,1106：控制菌检查法,金黄色葡萄球菌在血平板上的溶血环,48,1106：控制菌检查法,金黄色葡萄球菌在B_P平板上的菌落,49,1106：控制菌检查法,甘露醇发酵实验也可作为鉴别方法之一甘露醇发酵实验：甘露醇发酵培养基用于鉴别金黄色葡萄球菌的发酵甘露醇实验。蛋白胨和牛肉膏提供碳氮源、维生素及生长因子，氯化钠维持渗透压，甘露醇检测细菌发酵糖类的特性，溴麝香草酚兰为酸碱度指示剂，酸性呈黄色，碱性呈蓝色。灭菌后要保证指示剂的颜色，否则查找原因，从新配制。,50,1106：控制菌检查法,三种葡萄球菌的区别金黄色葡萄球菌：触酶试验（细菌产生的过氧化氢酶催化过氧化氢生成水和氧气，产生气泡）阳性、血浆凝固酶试验阳性、甘露醇发酵试验阳性表皮葡萄球菌：触酶试验阳性、血浆凝固酶试验阴性腐生葡萄球菌：触酶试验阳性、血浆凝固酶试验阴性血浆凝固酶有商品售，按照说明书操作和保存培养基应记录开启时间，按照说明书存放,51,1106：控制菌检查法,大肠埃希菌增菌：麦康凯液体培养基选择和分离：麦康凯琼脂培养基若有菌落生长应进行分离、纯化、及其适宜的鉴定。麦康凯琼脂培养基MAC：用于分离检定细菌的培养基，大肠杆菌在其上呈红色或粉红色，有的菌落只是中间呈现红色。由于含有胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌生长，有利于大