血红蛋白的提取和分离精ppt课件

.,1,课题3血红蛋白的提取和分离,专题5DNA和蛋白质技术,.,2,.,3,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。,人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,.,4,新华网首尔月日电（记者干玉兰）韩国浦项工业大学科学家日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“”蛋白质核心部分的结构。浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“”蛋白质内核心部分“”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期分子细胞杂志上。2年英国自然杂志曾刊登论文说，“”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究“”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。,.,5,我国对蛋白质的现阶段研究,我国独立主持国际“人类肝脏蛋白质组计划”，参加国际人类蛋白质组研究计划中的“大规模抗体制备”项目,.,6,思考1分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,.,7,思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,思考4人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,.,8,一、基础知识：,凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,.,9,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,.,10,.,11,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,.,12,.,13,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,缓冲溶液：,2、作用：能够抵制（）的对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,.,14,3、缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲液。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,.,15,电泳：,1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,.,16,2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,.,17,.,18,.,19,分类：,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定（）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,.,20,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,.,21,电泳检测结果,.,22,（四）血红蛋白,在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个肽链和两个肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。,.,23,.,24,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,.,25,二实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（）,两个a肽链,两个一肽链,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,.,26,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,.,27,1.洗涤红细胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,.,28,红细胞的洗涤,.,29,2.释放血红蛋白,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,.,30,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞混合液,.,31,分离血红蛋白溶液,有机溶剂无色透明的甲苯层,脂类物质白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液红色透明液体,红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物,.,32,二、粗分离透析血红蛋白,.,33,(三)纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,3.样品的加入和洗脱,.,34,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,.,35,3.样品的加入和洗脱,.,36,（四）纯度鉴定：凝胶电泳,.,37,注意事项,1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,.,38,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质,.,39,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较,.,40,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少