免疫细胞分离与功能检测PPT课件

-,1,目的要求,掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测；熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。,-,2,第一节免疫细胞的分离,3,免疫细胞的分离及检测,检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定方法：体外法为主目的：判断机体免疫状态意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效,免疫细胞的分离是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来,-,4,-,5,免疫细胞种类,-,6,免疫细胞的分离流程,-,7,PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离常用分层液：ficollhypaque，percoll,一、外周血单个核细胞的分离和纯化,-,8,外周血各细胞成分的密度,-,9,Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。Ficoll分层液：密度1.0770.001离心：密度梯度离心分离：各类细胞按其相应密度重新分布,一、Ficoll分离法,-,10,Ficoll分层液分离单个核细胞示意图,-,11,二、淋巴细胞的分离纯淋巴细胞群的采集原理：利用单核细胞在37和Ca离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。,-,12,(一)粘附贴壁法因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。(二)吸附柱过滤法将单核细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的主要是淋巴细胞,-,13,(三)磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。,-,14,（四）Percoll分离法,返回章目录,-,15,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,免疫磁珠分离法流式细胞术分离法其他方法,-,16,（一）免疫磁珠分离法,-,17,488nm激光,-,前向散射光检测器,荧光检测器,电磁场,单个细胞被分类进入检测管,流式细胞术分离原理示意图,-,18,第二节淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类,-,19,一、T细胞表面标志及亚群,CD4+TCD8+T,CD3+CD4+CD8-,CD3+CD4-CD8+,主要为Th（helpTcell）辅助性T细胞,主要为Tc（cytotoxicTcell）细胞毒性T细胞,-,20,二、B细胞表面标志及亚群亚群,-,21,NK细胞典型标志：CD56和CD16,三、NK细胞表面标志,-,22,第三节抗原提呈细胞表面标志,抗原提呈细胞（APC）：是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。,单核-巨噬细胞,树突状细胞,-,23,（1）分泌TNF-、NO、反应氧中间产物及蛋白水解酶等（2）ADCC效应（3）激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞协同杀伤肿瘤细胞。,（一）单核吞噬细胞（CD14）,1.吞噬和杀伤作用2.杀伤肿瘤细胞,-,24,形态呈树突样具有一些相对特征性表面标志抗原提呈能力强能激活初始T细胞免疫应答的始动者,二、树突状细胞（dendriticcells，DC）,特征：,-,25,1.起源于造血干细胞由髓样干细胞（多数）、淋巴干细胞分化。2.表面标志丰富如：MHC类分子及类分子、B7-1和B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。3.分泌多种细胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-、IFN-等。,DC主要标志：CD1a、CD11c、CD83,-,26,第四节T细胞功能检测,一、T细胞功能检测,-,27,-,28,形态学检查法3H-TdR掺入法MTT比色法,淋巴细胞转化的检测方法,-,29,形态学检查法,-,30,未转化和转化淋巴细胞的形态特征,-,31,原理：,刺激物,3756h,G1期S1期,合成DNA,3H-TdR,3716h,DNA-3H-TdR,测淋巴细胞内放射量（cpm）,计算SI,判断淋巴细胞转化程度,外周血（T）G0期,3H-TdR掺入法,-,32,评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。,刺激指数（stimulatingindex，SI）SI=试验管cpm均值/对照管cpm均值,3H-TdR掺入法,-,33,3H-TdR摻入法,-,34,原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/TH2细胞的百分率。,淋巴细胞内细胞因子检测,（二）T细胞分泌功能检定,-,35,Thl和Th2分泌的细胞因子,-,36,原理:,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,（三）T细胞介导的细胞毒试验,-,37,试验方法:同位素法淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定射线,51Cr特异释放率=,100%,（三）T细胞介导的细胞毒试验,-,38,（三）T细胞介导的细胞毒试验,背景无效应细胞,效应细胞/靶细胞1:1,效应细胞/靶细胞5:1,效应细胞/靶细胞20:1,细胞溶解,-,39,特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验,（四）体内试验,-,40,溶血空斑试验酶联免疫斑点试验体内试验,二、B细胞功能检测,-,41,（一）溶血空斑试验,溶血斑,补体,抗血清包被绵羊红细胞,-,42,（二）酶联免疫斑点法,抗体产生B细胞,抗原包被,酶联抗抗体,凝胶底物显色,-,43,刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,（三）体内试验,-,44,染色计数,离心取上清测LDH或AKP,测发光强度,测CPM值,形态法酶释法放射性核素释放法流式细胞术,靶细胞溶解,常用靶细胞:K562细胞株,三、NK细胞活性检测,返回章目录,-,45,大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统小吞噬细胞:即中性粒细胞,第五节其他免疫细胞功能检测技术,吞噬细胞的种类,-,46,特征性标志CD14分离技术Pecoll密度梯度分离法流式细胞仪分离技术免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法黏附法,一、吞噬细胞的分离,（一）单核细胞的分离,-,47,斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取,（二）巨噬细胞的分离,-,48,聚合物加速沉降法可从外周血中分离出白细胞,RBC,血浆,(抗凝血),WBC,RBC,Ficoll分离法可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞,（三）中性粒细胞的分离,-,49,Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞,-,50,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。（一）中性粒细胞功能检测技术（二）巨噬细胞功能检测技术,二、相关功能检测,-,51,细胞趋化功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测,（一）中性粒细胞功能检测,-,52,体内试验法：皮肤窗法体外试验法：滤膜渗透法琼脂糖平板法,趋化功能检测检测细胞运动功能,皮肤窗法在受检者前臂屈侧中央3范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般23h后开始聚集，达50100个，6小时可达1000个以上。,-,53,原理及技术要点在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，37温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。,滤膜渗透法,-,54,原理及技术要点在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育48小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向右孔的移动距离B，计算趋化指数。,趋化指数=A/B趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强,琼脂糖