支原体的清除.ppt

支原体的检测与清除,1,30-50%的细胞培养物中存在支原体污染。,支原体是细胞培养的一大顽敌,2,支原体（mycoplasma）：又称霉形体，是目前发现的最小的最简单的细胞，介于病毒和细菌之间。支原体在自然界的分布非常广泛，种类繁多。支原体分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属(Ureaplasma)，仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。与细胞污染有关的支原体则有好多种。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。,支原体的特征,资料来源：生物通,3,支原体是1898年发现的，其是简单的原核细胞，大小介于细菌和病毒之间。结构比较简单，多数成球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。,支原体的发现,资料来源：生物通,4,支原体与衣原体的区别,衣原体（chlamydia）是一类严格在真核细胞内寄生，有独特的发育周期，能通过0.45mm滤菌器的原核细胞型微生物。过去曾一直被认为是病毒，1956年我国学者汤飞凡教授等分离沙眼衣原体成功，证明沙眼病原体不是病毒。由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。主要是通过性接触传播，进入生殖道后，喜欢进入粘膜细胞内生长繁殖，在女性引起子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎、尿道炎等。在男性可引起尿道炎、附睾炎、直肠炎等炎症。女性感染沙眼衣原体，会引起不孕、异位妊娠(宫外孕)、流产、死胎、胎膜早破、早产。,资料来源：生物通,5,支原体种类举例,1A.laidlawii莱氏无胆甾原体2A.granularum颗粒无胆甾原体3Mesoplasmapleciae玉米蛆虫中间原体4Mycoplasmaarginini精氨酸支原体5M.hyosynoviae猪滑液支原体6M.gateae猫支原体7M.faucium咽支原体8M.canadense加拿大支原体9M.buccale上颌支原体10M.orale口腔支原体11M.salivarium唾液支原体12M.auris耳支原体13M.cloacale泄殖腔支原体14M.anseris鹅支原体15M.phocicerebrale16M.falconis猎鹰支原体17M.spumans泡沫支原体18M.sphenisci19M.timone20M.subdolum疑误支原体21M.alkalescens产碱支原体,22M.phocirhinis23M.maculosum斑状支原体24M.arthritidis关节炎支原体25M.bovis牛支原体26M.spermatophilum嗜精支原体27M.mustelae水貂支原体28M.caviae豚鼠支原体29M.columbinasale鸽鼻支原体30M.canis犬支原体31M.hyopharyngis猪喉支原体32M.fermentans发酵支原体33M.hyopneumoniae猪肺炎支原体34M.edwardii爱德华氏支原体35M.primatum类人猿支原体36M.opalescens乳白色支原体37M.zalophi38M.pulmonis肺支原体39M.collis希尔氏支原体40M.mobile运动支原体41M.indiense印第支原体42M.verecundum不活泼支原体43M.hyorhinis猪鼻支原体44M.gallopavonis吐绶鸡支原体45M.anatis鸭支原体46M.corogypsi黑秃鹫支原体47M.bovirhinis牛鼻支原体48M.alkalescens产碱支原体,6,支原体的体形多样，基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，其菌落呈针尖大小，故又称之为微小支原体。结构比较简单，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。支原体的大小为0.20.3um,可通过滤菌器。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。,支原体的形态结构,资料来源：生物通,7,支原体基因组为一环状双链DNA，分子量小，1700kb（仅有大肠杆菌的1/5），500个基因，自我复制，合成与代谢很有限。在细胞外生殖，采用精氨酸、葡萄糖、脲代谢途径；需要胆固醇、氨基酸、脂肪酸、维生素、其它分解代谢物等；对渗透压不稳定。,支原体的代谢特点,资料来源：生物通,8,支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养时，营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入1020%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.88.0之间，低于7.0则死亡，但解脲脲原体最适pH6.06.5。大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育23天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径1016um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式，分裂时二个子细胞大小均匀。另外，支原体分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。由于没有细胞壁，因此对影响细胞壁合成的抗生素，如青霉素等不敏感，但红霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素，可抑制或影响支原体的蛋白质合成，有杀伤支原体作用。在培养基中置入脲素并以硫酸锰作指示剂极易与其他支原体作出鉴别。,支原体的培养特性,资料来源：生物通,9,一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类。解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。各种支原体都有特异的表面抗原结构，很少有交叉反应，具有型特异性。应用生长抑制试验（Growthinhibitiontest,GIT）、代谢抑制试验(Metabolicinhibitiontest,MIT)等可鉴定支原抗原，进行分型。,支原体的生化特性与分型,资料来源：生物通,10,支原体对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂。对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大。石碳酸，来苏儿易将其杀死。对影响壁合成的抗生素如青霉素不敏感，但红霉素、四环素、链霉素及氯霉素等作用于支原体核蛋白体的抗生素，可抑制或影响蛋白质合成，有杀灭支原体的作用。支原体对热抵抗力差，与细菌相似，通常55经15分钟处理可使之灭活。,支原体的抵抗力,资料来源：生物通,11,很多支原体能够致病。肺炎：肺炎支原体（M.Pneumonia）。泌尿生殖道感染：人型支原体（M.humenis，MH）、解脲支原体（Ureaplasmaurealyticum，UU）和生殖器支原体（M.genitalium，MG）。关节炎：M.fementans,M.arthritidis中枢神经：肺炎支原体（M.Pneumonia）心脏：肺炎支原体（M.Pneumonia）,支原体的致病性,12,支原体致病机理,支原体引起细胞损害：粘附于宿主细胞表面的支原体从细胞吸收营养，从细胞膜获得脂质和胆固醇，引起细胞损伤；支原体代谢产生的有毒物质，如溶神经支原体能产生神经毒素，引起细胞膜损伤；脲原体含有尿素酶，可以水解尿素产生大量氨，对细胞有毒害作用。支原体可以粘附于精子表面，从而阻止精子运动，其产生神经氨酸酶样物质可干扰精子与卵子的结合。这就是支原体感染引起不育不孕的原因之一。,资料来源：生物通,13,1.抑制细胞增殖：50%，竞争营养，分泌有害代谢产物迅速降低培养液中葡萄糖，形成酸，改变Ph值；消耗精氨酸抑制蛋白合成细胞分裂减慢停止生长2.改变细胞特性改变细菌细胞壁的完整性改变基因表达谱消耗50%的总蛋白降低转染效率产生染色质凝聚几乎影响宿主细胞所有的功能！,支原体对细胞培养的危害,14,1.抑制病毒扩增：竞争蛋白(50%)与核酸(15-30%)2.改变细胞特性：导致病毒扩增受阻3.影响病毒感染效率：影响病毒疫苗效价4.影响疫苗对动物的免疫效果5.提高疫苗生产成本6.对畜牧业生产带来隐患,支原体对病毒疫苗生产的危害,15,支原体对细胞培养污染的频率,莱氏无胆甾原体,精氨酸支原体,猪鼻支原体,口腔支原体,人型支原体,发酵支原体,唾液支原体,修改自VenorGeM公司,16,支原体污染源,口腔支原体（M.orale）精氨酸支原体（M.arginini）猪鼻支原体（M.hyorhinis）莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）,工作环境操作者本身培养基细胞交叉污染实验器材原始组织或器官,大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。,95污染源,支原体污染的来源,17,支原体污染的检测,定期检测支原体污染的必要性：1.细胞培养条件是支原体生长的最佳环境，污染随时可能发生；2.即使支原体含量达107108个/ml，亦无明显征兆；3.普通光学显微镜不能发现污染；4.普通抗生素使污染在检测值之下，稍有变化就会爆发。青霉素不能够防止污染。,18,支原体污检测的立法及对象,美国FDA：21CFR610.30法案美国USDA：联邦法#9CFR113.28欧洲药典2.6.7附则5.8ICH生物技术及生物产品指南,各种生产性细胞培养，贮存的病毒株来源于细胞培养的产品（抗生素，激素，免疫激活剂，血液产品）人用及兽用疫苗,InternationalConferenceonHarmonisation,国际立法,对象：,EuropeanPharmacopoeia,19,中华人民共和国兽用生物制品规程和中华人民共和国兽用生物制品质量标准规定：兽用疫苗半成品或成品必须检测支原体合格！,支原体污检测的立法及对象,20,病毒疫苗生产管理及质量控制要点规定：,生产管理要点：,原料及辅料生产用器具生产用动物生产用细胞株生产用种毒,质量控制要点：,种子批原代/传代细胞病毒收获病毒原液半成品/成品,资料来源动物生物疫苗冯忠武主编,21,支原体污染检测的方法,荧光染色法：简单，活支原体操作稍复杂，费时不能断定种类，需要有经验,资料来源：生物通,22,清华资料,23,支原体污染检测的方法,培养法：培养基及培养条件要求严格；不同种类的培养条件不一致；特别费时（14周）；分析困难；肉汤培养和平皿培养均行；优点：仅检查活支原体；敏感度：1CFU-30GU。,WhatarethedifferencesbetweenGenomicUnitsandColonyFormingUnits?ThereisadifferencebetweenGUandCFUastheydefinedifferentpropertiesofthecells.CFUisameasureunitoftheabilityofacelltoformacolony.GUisameasureofDNApresentinasinglecell.GUvaluesareoftenhigherbecauseitdetectsstressedcellsorintra-organellecellswhichwouldntnormallybedetectedbyculturemethods.,修改自VenorGeM公司,24,支原体污染检测的方法,（1）肺炎支原体培养基基础培养基70ml牛血清（灭活）20ml25的酵母浸液10ml50葡萄糖12ml0.4酚红0.5ml制霉素0.001g青霉素10万IUpH7.8,基础培养基：Hayflick培养基（PPLO培养基），牛心粉50g蛋白胨10g氯化钠5g加14g琼脂粉为固体培养基,（2）人型支原体培养基基础培养基70ml马血清20ml25的酵母浸液10ml30L精氨酸0.33ml0.4酚红0.5ml制霉素0.001g青霉素10万IUpH6.3,（3）解脲支原体培养基基础培养基70ml马血清20ml25的酵母浸液10ml30尿素0.33ml0.4酚红0.5ml制霉素0.001g青霉素10万IUpH6.0,注：由于支原体能在人工培养基上生长，但是营养要求较高，需要提供胆固醇和酵母才能生长。以上配方中，马（牛)血清提供胆固醇，酵母浸液提供酵母。,资料来源：,培养法,25,支原体污染检测的方法,（1）Dienes菌落染色美蓝2.5g天青1.5g麦芽糖10g碳酸钠0.5g蒸馏水100ml染色时，直接吸染色液覆盖菌落，1min后，用生理盐水洗去染色液，低倍镜下可见支原体菌落呈蓝色，而其他菌体菌落不着色。,培养条件：培养温度37，510CO2。接种量104105cfu。解脲支原体培养1618h即可达到对数生长期。人型，肺炎，2448h即可达到对数生长期,（2）生化反应特异代谢物反应：解脲支原体分解尿素不分解精氨酸，生成NH3使培养基的ph升高，酚红指示剂变红。人型支原体分解L精氨酸不分解尿素，生成NH3使PH值升高，酚红指示剂变红。肺炎和人型支原体分解葡萄糖，使pH降低，酚红指示剂由红变黄。,（3）特异性生长抑制试验在含0.002%美蓝的培养基中肺炎支原体能生长且将美蓝还原而退色，其他口腔、唾液或发酵支原体均被抑制生长，此法可鉴定肺炎支原体。,资料来源：,培养法,Dienes染色液,26,支原体污染检测的方法,核酸扩增法：商业试剂盒可以任选；欧洲药典2007年7月通过；必须根据灵敏度、特异性、鲁棒性与已经典方法进行比较；如果灵敏度为检出率低于100cfu/ml,则可代替指示剂法；如果灵敏度为检出率低于10cfu/ml,则可代替培养法；快速诊断；细胞培养富集后可提高灵敏度。,27,支原体污染检测的方法,核酸扩增法,目前有好多试剂盒，价钱较贵。,M,-,修改自VenorGeM公司,105,104,103,102,101,100,内对照,特异带,结果判定：,28,支原体污染检测的方法,核酸扩增法,清华资料,问题：,系统出错；核酸提取出问题；反应周期过长或过短；,4.样本的可比性；5.反应体积；6.PCR仪的稳定性。,只阳不阴：千万以上；半阳半阴：千级左右；只阴不阳：一个以下。,29,支原体污染检测的其它方法,化学发光检测法：,嘌呤核苷磷酸化酶(6-MPDR)实验：,酶联免疫检测法：,需要化学发光检测仪；最低灵敏度为105CFU；样品质量要求高，易使用,无需检测仪；需要细胞系；灵敏度差；易操作,需要ELISA检测仪；对支原体的种类特异灵敏度适中为106CFU/ml；集中测定,30,支原体污染的清除,支原体清除非常困难！,毛主席语录：一个人做一件好事并不难，难的是一辈子做好事，不做坏事！,31,目前国内支原体污染的现状,资料来源：宁宜宝冀锡霖中国兽药杂志1993年27卷1期,1987-1990,32,目前国内支原体污染的现状,任杰，张绍芬，张映中国畜牧兽医2008年35卷10期,2005,2008,33,目前国内支原体污染的现状,2009-2010,猪瘟弱毒苗,蓝耳弱毒苗,口蹄疫灭活苗,内部结果，不得外传,34,支原体污染清除刻不容缓！,支原体污染不清除，后果很严重！,疫苗生产不合格！,35,支原体污染防止方法,.严格操作！.定期对环境消毒！.定期做支原体检测！.避免互相交叉感染！,36,支原体污染清除方法,.高压灭菌！.完全固定！.破坏DNA！,37,细胞培养中支原体污染清除方法,.抗生素：,一般活性：Ciprofloxacin(Ciprobay,Ciproxin),Doxycyclin,低活性：Plasmocin,Chloramphenical,Clindamycin,Azithromycin,Clarithromycin,Tetrac