流式细胞术基本原理及应用ppt课件

流式细胞术原理及应用,ForFCMTraining,2,流式细胞术,流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,3,流式细胞仪系统,简介通过流式细胞仪我们可以得到以下信息-相对细胞大小-相对细胞颗粒密度和内部复杂度-染色过细胞的相对荧光强度,4,5,流式细胞仪的光信号,散射光信号荧光信号,6,1.散射光信号,前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。,7,前向角散射光FSC,ForwardAngleLightScatter,8,侧向角散射光SSC,9,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,10,散点图DotPlot,lysedwholeblood,11,ReviewQuestion,Deadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?,A,B,12,2.荧光信号,荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,13,荧光检测器,14,Two-ColorCellAnalysis,WhichofthethreepopulationshasthemostAbAbindingsites?,AbA,AbB,15,双色荧光散点图,16,现代流式细胞仪包括,液流系统聚焦细胞以供检测光学系统激发和收集光信号电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析,17,液流系统,液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处,18,SampleFlowinOpticalCuvette,Sample,LaminarFlow,LowSampleFlowRate12mL/min,Sheath,Sheath,Sample,LaminarFlow,Sheath,Sheath,OpticalCuvette,HighSampleFlowRate60mL/min,19,ReviewQuestion,Whichofthefollowingwouldcausedisturbanceinthelaminarflowoftheopticalcuvette?bubblescellularconcentrationsampleflowrate,20,Optics,Excitationopticsconsistof:LasersLensesandmirrorsthatroutethelaserlighttothefluidicstreamCollectionopticsconsistof:Filtersthatdirectthesignalstotheappropriateopticaldetectors,21,OpticalFilters,460500540,460500540,460500540,SP500,LP500,BP500/50,LongpassShortpassBandpass,22,FACSCalibur光路图,23,Optics,488nm,635nm,24,Electronics,ConvertsanalogsignalstoproportionaldigitalsignalsComputesHeightforeachpulseCalculateswidthandareaInterfaceswiththecomputerfordatatransfer,25,CreationofaVoltagePulse-AnalogSignal,26,QuantificationofaVoltagePulse,Heightisameasurementforallparameters.Width=Area/Height,27,EffectoftheInstrumentControlsontheData,InstrumentControls,Detector,FSCdetector250gain,FSCdetector350gain,28,Review,DataProcessing,29,ReviewQuestions,WhichofthefollowingfluorochromescannotbeusedwiththeFACSCalibur?DAPI(ex.345nm,emits455nm)PropidiumIodide(ex.536nm,emits617nm)AlexaFluor647(ex.650nm,emits668nm)WhatarethethreemeasurementsofaparticlethatcanbedeterminedbyFACSCalibur?Brieflydescribethefunctionsofthefluidics,optics,andelectronicssystems.,30,ReviewQuestions,WhatwouldhappentothepopulationbelowifyouincreasedtheRedparametervalueintheInstrumentcontrols?,31,ReviewQuestions,Whichinstrumentcomponentsensurethatthefluorescencesignalofaspecificfluorochromeisonlymeasuredbyadesignateddetector?Forexample,APCisonlymeasuredbytheFL4detector.,32,样本处理,33,细胞悬液的制备,细胞悬液：分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小灌洗液、体腔积液培养细胞、细胞系实体组织：病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本针吸组织：新鲜样本鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质,34,步骤一：选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少,35,荧光产生过程,36,PropidiumIodide,400nm,500nm,600nm,700nm,PI,DNA,Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,37,Fluorescein(FITC),400nm,500nm,600nm,700nm,Wavelength,Protein,Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,38,Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,Phycoerytherin(PE),Protein,39,Allophycocyanin(APC),Protein,632.5nm(HeNe),Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,40,FITC和PE荧光光谱,41,补偿模型图,42,补偿调节前后对比,FL1,FL2,43,步骤二：染色,体积温度孵育时间对照,44,直接染色,FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low,45,间接染色,Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high,46,Avidin-BiotinmethodI,biotinylatedprimaryAb,biotin,avidin,biotinylateddye,47,示意图,48,步骤三：数据收集和分析,画图寻找目标细胞调整仪器设置到合适的状态我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？,49,仪器设置调节,1.用未染色细胞调整仪器PMT电压,2.用单染色的细胞调节仪器补偿,50,关于同型对照,例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：FITC:细胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:细胞加上AbBPE,IgG1FITC,51,数据分析,设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数,52,如何设定阴性与阳性的界限,53,54,55,直方图,56,散点图,57,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡,在上述信号基础上的细胞分选,流式细胞术的细胞学应用,58,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,59,流式细胞仪的科研应用,免疫功能研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究动物性别筛选海洋与环境微生物分析染色体分选,60,流式细胞仪的遗传学应用,细胞DNA,RNA含量的测定染色体倍体分析染色体分离基因表达产物的生物活性研究基因转染表达的生物效应基因表达调控研究细胞内基因定位酵母转基因株的筛选报告基因的定性定量检测植物遗传学研究,FlowCytometry,inclinicsandresearch,62,WhatcanFlowCytometertellusaboutacell?,63,细胞增殖（细胞周期）,细胞内DNA含量增殖相关基因的表达BrdU的结合示踪染料,64,DNA探针,DNA探针最主要的特点是，它们与DNA含量是成化学正比关系的这样，带有的探针荧光分子的数目就和DNA分子的含量相当，从而检测DNA含量,65,NucleicacidProbes,菲啶基PropidiumIodideEthidiumBromide苯甲亚胺Hoechst33342抗生素Mithramycin,ChromamycinA3AcridineOrange-AOPyronynY,66,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNAAnalysis,DNAcontent,Count,NormalCellCycle,67,AtypicalDNAHistogram,G0-G1,S,G2-M,FluorescenceIntensity,#ofEvents,68,红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体细胞,69,70,增殖相关基因,PCNA(Proliferatingcellnuclearantigen)一种蛋白质，在DNA复制和核苷酸的切除修复中起到作用Ki-67-proliferationrelatedantigenKi-S1-proliferationrelatedantigenPhospho-histoneCyclinD1,E,A,B1,71,BrdUrdIncorporation,Bromodeoxyuridine(BrdU)是一个胸腺核苷的类似物能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合使用BrdU抗体能够检测到BrdU,72,BrdUrdIncorporation,73,细胞分裂的分析,哺乳动物的免疫系统需要有大量的增殖，能够确保抗原特异性的T细胞和B细胞具有足够的增殖速度，能够对付治病生物造成的感染CFSE是一种示踪染料，能够均等地在两个子代细胞中分布，其结果可以区分出8-10代的子细胞。,74,TracingDye(CFSE),ApoptoticCellDeath-ageneticallyencodedcelldeathprogram,whichismorphologically,biochemicallyandmolecularlydistinctfromnecrosis,76,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,细胞散射光在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化,77,78,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,荧光吸收细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞,79,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,FCMofCaspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测使用特异性的caspase-3荧光底物新的抗原决定基CK18,80,81,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,线粒体功能的变化TMP会在调亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123,DiOC6,JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探针。当细胞发生调亡时，一个线粒体膜表面蛋白7A6抗原会出现Bcl-2/baxfamilyofproteins.,82,83,84,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,钙离子流和pH值变化胞浆内Ca2+水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。使用Ca2+选择性荧光探针，如Quin-2,Fluo-3,Indo-1通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如DCH,BCECF,BCECF-AM,SNAFLs,SNARFs等进行检测,85,FlowcytometryofapoptoticcelldeathPhospholipidredistribution,86,87,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,DNA链的断裂细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。断裂的末端可以通过末端转脱氧核苷酰酶(TdT)连接上dUTP。,88,89,90,91,Flowcytometryofapoptoticcelldeath,细胞DNA含量在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。,92,FlowCytometryofApoptoticCells,AnIntegratedApproachtoCellImmunology,94,ImmuneFunctionassay,免疫细胞亚群检测Antigen-peptidespecificTcells检测T-cells活化TregCells细胞内细胞因子/趋化因子检测磷酸化,95,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,96,淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血,97,98,TraditionalAnalysis-Percentpositive,Positivecell,NegativeCell,CD4PE,CD4PE,99,AbsoluteCounts-CellspermL,PositiveCell,AbsoluteCountBeads,NegativeCell,CD4PE,CD4PE,100,抗原特异性T细胞,提供检测者一个强有力的工具用于研究对病毒抗原的免疫应答和疫苗的开发,101,MHC:ClassIandClassIIGeneProducts,Tcell受体不直接和可溶性抗原相连抗原必须通过MHC由抗原呈递细胞传递给T细胞(Macrophages,Dendriticcells,Bcells)MHCClassIGeneProducts呈递抗原给CD8+Tcells诱导细胞毒应答MHCClassIIGeneProducts呈递抗原给CD4+Tcells诱导细胞因子产生，免疫球蛋白的分泌,102,MHC/TCRSignaling,103,二聚体可溶性MHC类似物与四聚体的比较,104,Quantitationofantigen-specificTlymphocytesinperipheralblood,HAM,Control,HIV,CD8,Tax-A2/Ig,Gag-A2/Ig,105,Treg细胞的检测,Treg细胞与自身免疫耐受相关，通常的检测方法用CD4阳性细胞中CD25高表达，同时结合胞内FoxP3含量来判断最新发现人的Treg细胞低表达CD127。CD127的表达模式与Foxp3很接近，说明低表达CD127，高/中表达CD25的CD4阳性的T淋巴细胞就是Treg细胞（调节性T细胞）。该方法比胞内检测Foxp3的优点在于，检测后的细胞可用于后续的培养及其他的体外试验。另外的优点是用这种检测方案分选的Treg细胞得率更高。,106,107,ImmuneFunctionAssays-APowerfulResearchToolforAnsweringBasicBiologicalQuestionsin.,AIDS或癌症机理的研究Tcell亚群对于病毒和细菌抗原的反应细胞介导的对机会感染的免疫反应药物/疫苗的效果评价免疫调节移植监控毒理研究,108,109,110,111,TraditionalCytokineFlowCytometry,IL-2Phycoerythrin,CD4FITC,112,细胞因子检测,细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能调节方面发挥重要作用。细胞因子可以调节多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答，研究生理或病理免疫调节因素所致细胞因子合成的应答与改变是研究疾病病因与免疫状态的重要工具。,113,T细胞的细胞因子分型,型细胞介导免疫反应引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调刺激来源：病毒、某些细菌型体液介导免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源,114,细胞因子,115,BiologicalVariationAmongCMV-seropositiveDonorsinResponsetoCMV,116,CFC&Proliferation,使用温和的方法进行细胞破膜和固定，在中性pH值条件下，使细胞和BrdU结合，可以同时检测到：S期细胞周期表型活化状态核型决定基胞浆内决定基细胞因子/趋化因子其他.,117,CFC&Proliferation,Allowsthecorrelationof:PhenotypeCytokineexpressionCellCycleProliferation,118,BDPhosflow磷酸化检测系统,更好的特异性的抗体建立在单个细胞基础上的检测可以同时检测多个参数快速、灵敏、样本量更少,119,Y,Y,Y,Y,非磷酸化特异性抗体检测全部的相关蛋白unphosphorylated+phosphorylated亚型抗原：重组的蛋白质片断磷酸化特异性抗体仅仅检测磷酸化亚型抗原：合成的4-10mer磷酸化肽段,Y,磷酸化特异性和非磷酸化特异性抗体的差异,120,BDPhosFLOW和Westernblot的比较,AtheoreticalexperimentcomparingWesternblotandflowcytometrywiththreesamplesandaproteinofinterestat1,10,or50copiespercell.Sample2and3lookthesameviaWesternblot,butwhenstainedwithfluorescentlylabeledantibodies,thedifferencesbetweenthesamplesbecomemorerelevant.(Source:P.O.Krutziketal./ClinicalImmunology110(2004)206221),121,BDPhosFlow,Genomics&Proteomics-SingleCellsHaveBigProteomicsStorytoTell.,BDPhosFlownotonlytellsyouactivationofasinglecellforoneparticularphosphoproteinandpathway,butallowsyoutostudymultiplephosphorylationeventsandpathwayssimultaniously.,122,CD20PerCP-Cy5.5,CD3PE,Zap70(Y319)/Syk(Y352)Alexa647,CD3PE,CD3-/CD20+,CD3+/CD20-,CD3-/CD20-,CD20PerCP-Cy5.5,WholeBloodCD3CrossLink,Multi-ColorPhosFlowinCD3/CD28orCD3crosslinkedhumanPBMCsorWholeBlood,CD3/CD28Crosslink,Untreatedcells(unshaded)vstreatedcells(shaded),123,BDCBA,一种“三明治”免疫测定法使用结合有高亲和性抗体的小球，用来特异性地捕获可溶性的抗原.用荧光检测抗体来检测被捕获的抗原使用流式细胞仪进行检测分析,124,125,MultiplexedBeads,Shadesofacolor,Antibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensities,Variousanalytes,AntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.,126,MultiplexedBeads,0pg/mL,80pg/mL,1250pg/mL,5000pg/mL,FL3Beads,FL2(PE),127,使用BDCytometricBeadArray(CBA)系统你可以:,从单一小体积样本中得到多项检测结果对所有的检测项目，只需要制备一个标准混合物来绘制标准曲线避免人为造成的酶联放大的假阳性信号产生用更少的时间和精力，却得到大量的结果如果是用488nm和635nm两根激光器来实验，实验条件更容易建立使用配有HTS选件的BD流式细胞仪可以做到自动平板上样和高通量检测,128,目前CBA主要提供的检测内容,可溶性细胞因子细胞凋亡相关蛋白磷酸化蛋白,129,BDCBAFlexSet,OldFormatBDCBABeads,BDCBAFlexSetBeads,130,更为灵活强大的CBAFlexSet,最多可同时检测72个项目可自由选择搭配检测项目检测项目范围更广泛需要488nm和635nm两种波长的激光器,131,9个指标同时检测活化T细胞,1,2,3,4,5,6,7,8,9,1.Itk(Y511)2.ERK(T202/Y204)3.JNK(T183/Y185)4.P38(T180/Y182)5.PLCg(Y783)6.ZAP70(Y319)7.LAT(Y171)8.c-Jun(S63)9.RSK(S380),132,KineticsofJurkatCellActivationWithAnti-CD3/CD28,1,10,100,FOLDINCREASEINUNITS/ML,0,5,10,15,20,TIME(MINUTES),RSK(S380),Jun(S63),LAT(Y171),Itk(Y511),ZAP-70(Y319),PLCg(Y783),P38(T180/Y182),JNK(