代谢调节与代谢工程ppt课件.ppt

1,3.5代谢工程,2,3.5.1代谢工程概述,细胞的生命活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化系统构成。对人类的应用而言，活细胞自身固有的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为了积累大量的某种代谢产物，就必须要打破并重建细胞的代谢平衡。,3,代谢工程概念演变代谢工程又称途径工程，最早由美国加州理工学院化学工程系教授BailyJ.E.于1991年提出的。随后Stephanopoulos认为，代谢工程是一种提高菌体生物量功代谢物产量的理性化方法。Cameron认为代谢工程是动用重组DNA技术有目的地改造中间代谢的方法。现在的定义：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。,4,5,代谢工程要解决的问题目前代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不同途径中的流量分布。典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物的最大转化率。,6,主要应用方向(1)提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；(2)改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；(3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物；(4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。,7,代谢工程研究思路解析反应体系，找到能反映细胞生理状态的主要参数；如何利用这些信息组织一个代谢网络的控制设计，并确定合理靶点以修饰构建特定的物种；怎样正确评估基因或酶的真实修饰效果，以实施新一轮的代谢网络修饰直到确立最佳状态，从而取代普通的定向靶点筛选程序；代谢工程关注的是代谢途径的组合而不是单一的反应，因此必须考察完整的生化反应网络，重视代谢网络和目标产物的热力学可行性，代谢流及其控制。代谢工程最为突出的特征是强调生化反应途径与代谢流及其体内条件的控制相关联。,8,代谢工程的首要工作就是利用在广泛而深入的研究中获得的技术信息进行组合设计。将代谢流的定量分析方法与代谢流控制的分子生物学技术结合在一起，系统、合理地修饰生物细胞的遗传性状，是代谢工程的基础。,9,系统研究代谢流及其控制机制包括以下三大基本步骤建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测定其流量的方法。为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进行简单的物料平衡。由于一个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性，所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的代谢流信息，除非相应的酶在体外分析条件下存在并具有活性。因此，在代谢分析中，酶法分析常会错误地显示相似数量级的代谢流，从而导致产生不正确的结论。,10,在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统松散之后达到新的稳态时的代谢流。常用的扰动方式包括启动子的诱导、底物流加、特定碳源消除或物理因素变化等。虽然任何有效的扰动对代谢流的作用都是可以接受的，但扰动必须定位于近邻途径节点的酶分子上。一种扰动往往能提供多个节点上的相关信息，这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是至关重要的。,11,要系统分析代谢流扰动的结果。如果某个代谢流的扰动对下游代谢流并未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游的扰动是刚性的，相反则成为柔性的。一般地，在刚性节点处，不能通过改变上游酶活性来影响下游代谢流。,12,二、代谢工程的研究内容,代谢工程涉及的主要内容包括：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作。,13,1代谢网络理论,代谢网络理论把细胞的生化反应以网络整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又彼此互相协调。各种代谢都不是孤立进行的，而是相互作用、相互转化、相互制约的一套完整、统一、灵敏的调节系统。,14,节点：网络分流处的代谢产物称为节点。柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象,15,如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称为依赖型代谢网络。依赖型代谢网络的存在会给代谢工程的实施带来很大的困难。如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网络为独立型网络。,16,2代谢分析,代谢分析是代谢工程的重要组成部分。它涉及代谢流的定量和定向、研究细胞内代谢物浓度的反应工程方法以及细胞内稳态流分析等。代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡计算细胞内的代谢流。,17,放射性标记、同位素示踪等技术的应用使代谢流分析更简单、方便。通过对细胞在不同情况(如改变培养环境、去除抑制、增加或减少酶活等)的代谢流分析，便可确定节点类型、确定最优途径、估算基因改造的结果、计算最大理论产率等。对于简单的反应系统，通过对所有的代谢网络的精准分析及平衡计算就可以得到满意的结果。但是，对于比较复杂的代谢系统，代谢流分析就显得棘手。,18,代谢中间产物作为生物合成的前体及能量供应者，转向终产物的碳流的大小将最终决定终产物的产率。中间代谢产物的代谢流改变会受到细胞的抑制，并引起胞内功能的严重改变。传统的代谢工程对中间产物的生理作用考虑较少，从而使产率远远达不到所计算的理论最大产率。,19,弹性系数和流量控制系数是代谢控制分析研究的两个主要指标。弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速率的影响程度。而流量控制系数则为单位酶变化量引起的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡量某一步酶反应对整个反应体系的控制程度。这两个系数相互关联，可直接或间接测定。,20,细胞对于基质的吸收与产物的释放模型及分析也是代谢工程的重要组成部分。它包括物质转运过程的生化基础(如转运蛋白机制、转运动力学、载体介导转运中的能量偶连以及细胞转运活性的调节等)、研究方法、过程控制(如生物工艺过程中营养和吸收的关系、生物工艺过程中产物的分泌控制、干扰代谢流的结合以及转运过程的建模)等。,21,代谢工程基本过程,22,3代谢工程的基本过程,(1)代谢分析与代谢设计代谢工程的研究对象是代谢途径，因此必须对代谢网络中的一些酶及产物进行研究和分析。相对随机突变而言，代谢工程的一个显著特点就是工作具有定向性，因为它在修饰靶点选择、试验设计以及数据分析方面占有绝对优势。,23,代谢分析与代谢设计对代谢工程的成败起着关键作用，任何精细的靶点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡的检验。,24,(2)基因操作利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平对基因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括对靶基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控、构建特殊的基因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体上的稳定整合。在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的控制和分析也可绕过基因操作，直接通过发酵和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代谢流，并强制使代谢流流向期望的目标产物。,25,(3)效果分析很多研究结果表明，一次性的代谢设计和基因操作往往并不能达到实际生产所要求的产量、速率或浓度，因为大部分实验涉及的只是与单一代谢途径有关的基因、操纵子或基因簇的改变。然而通过对新途径进行全面的效果分析，根据由初步代谢操作所构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改进目标，如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。,26,4代谢工程的研究手段,代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技术方面主要有下列三大常用手段：(1)检测技术常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的物料平衡的同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。,27,(2)分析技术在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造的思路。这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组合法以及代谢网络优化技术等。,28,(3)基因操作技术在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA在细胞内的稳定维持等。代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种（包括人体）中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发。,29,5代谢改造思路,代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。,30,(1)改变代谢途径方法加速限速反应增加限速酶的表达量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。改变分支代谢途径流向提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。,31,(2)扩展代谢途径在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。(3)转移或构建新的代谢途通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。,32,三、代谢工程发展趋势,传统的代谢工程是以代谢网络理论为基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻碍了它的应用。逆代谢工程,33,代谢工程有关术语,(1)途径是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其他细胞功能的酶促反应的集合。(2)代谢网络:分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。(3)通量:物质或信息通过途径被加工的速率。,34,(4)代谢主流：在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该条件下的代谢主流。代谢途径的延伸和剪接都可能改变代谢主流，从而实现新基质的利用和新产品的开发。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。(5)载流途径：代谢主流流经的代谢途径为主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途径，即生产所需产物期间让碳流相对集中流向产物合成的途径。,35,(7)代谢主流的变动性和选择性：微生物的代谢主流处于不断变化之中，其方向、流量甚至代谢主流的载流途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。,36,2代谢物流及相关特性,(1)代谢物流与酶的关系代谢反应的速率与细胞内酶和代谢物的浓度有关。在代谢工程中把酶促反应看成是代谢系统的基本组成，而把基因、酶的水平、代谢物浓度、抵制机制、效应物、抑制剂、激活剂、环境条件等的影响看成是对酶促反应的扰动。因此，可以结合酶的反应动力学性质描述代谢网络特性。,37,具有一个分支点的简单代谢途径,38,Cx=C1时，X浓度变化对反应B、C速率无响应；Cx=C3时，反应B、C速率对X浓度变化的响应相同此上两种现象即称X处的分支点为刚性节点。CX=C2时，X浓度微小变化将对B、C反应速率造成不同的影响，VA与VB+VC交点处的浓度称为稳态浓度。,X浓度,VB+VC,稳态浓度,39,结论：典型的物流与酶量之间的关系大致呈双曲线形。,40,(2)物流限制作用的克服代谢途径存在着固有的限速步骤，它们控制着流经代谢途径的代谢物流，其主要特征表现在：限速步骤的反应速度很低，整个系统的代谢物流取决于催化该反应步骤的酶活性；限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋白合成的调节。调节方法：(a)等量提高所有酶的量；(b)提高限速酶的量。鉴别出具有高的流量控制系数的酶比超表达个别酶往往能获得更好的结果。,41,(3)反馈抑制与限制流在代谢改造过程中，利用色氨酸类似物5-甲基色氨酸分离抗色氨酸突变株，有利于色氨酸的生产。,色氨酸合成途径,反馈抑制,42,反馈抑制的特征只有代谢的终产物或它的结构类似物具有反馈抑制作用；受抑制的一般是代谢途径的第一个酶；反馈抑制作用是可逆的。由于这种抑制作用的可逆性，所以细胞才具有调节代谢的作用。,43,消除反馈抑制作用的主要效果在于增加代谢中间体的浓度，而对物流的影响很小。超表达单个酶不能增加代谢物流。大量研究结果表明，物流的控制分布在多个酶上，在任何情况下解除单个酶的反馈抑制作用是有限的，特别是在途径起点受反馈抑制的酶是物流控制不敏感之处，尽管它对代谢物的浓度有很大的影响。想通过单个酶来提高代谢途径的物流是行不通的，除非此酶具有很高的流量控制系数。,44,3代谢途径分析,45,依赖型网络中，若要提高目标产物的转化率，则这两个节点的流量分配必须同时改变。独立型网络，节形成的方向改变，能在某点或处的流量分配朝有利于产物种程度上提高其产率。网络的刚性程度最终取决于将主要节点的流量分布转变成最适于产物形成的流量分布的难易程度。,46,主要节点刚性的评估若能获得细胞生物化学代谢网络图表中全部详细的酶促动力学表达式，便可建立一个相关的代谢数学模型，对主要节点的刚性进行分析判断。但此以数学模型为基础的判断是有局限性的，因为它所涉及的细胞反应动力学的信息往往不很详细。代谢挠动首先测定网络主要节点在稳定状态下的流量分配，然后对该系统施加一个有效的扰动，再以相同的程序测定新稳定态下所达到的流量分配。仔细比较两者即可获得节点刚柔性的有关信息。只有建立在节点刚性评估上提出的代谢途径改造和操作方案，才是合理有效的。,47,3.7,1.1,16.1,代谢途径中的代谢流量分配率,胞外积累的代谢流量分配率,酿酒酵母代谢通量分析,15.8,36.9,(a)典型实验条件下的代谢分配图,48,3.3,0.9,4.6,代谢途径中的代谢流量分配率,胞外积累的代谢流量分配率,酿酒酵母代谢通量分析,15.3,61.5,(b)平衡条件下的代谢分配图,49,0,0,50,代谢途径中的代谢流量分配率,胞外积累的代谢流量分配率,酿酒酵母代谢通量分析,0,0,(c)1,6-二磷酸果糖最大产率时的代谢分配图,50,2主要柔性节点的判断(1)葡萄糖-6-磷酸节点(非刚性),代谢途径中的代谢流量分配率,胞外积累的代谢流量分配率,括号中的值为代谢途径的整体量,Mg2+对酿酒酵母糖酵解代谢能量的影响,不添加Mg2+,添加50mmol/lMg2+,51,(2)1,6-二磷酸果糖节点(非刚性),添加0.05mmol/lEDTA,添加30mmol/lNH4Cl,52,1,6-二磷酸果糖的大量积累的实现,实验中添加K+用于激活磷酸解酮酶，添加NH4+解除ATP浓度过高对磷酸激酶产生的抑制作用，使1,6-二磷酸果糖在合成初期能够快速积累，从而提高磷酸解酮酶的活性，同时，减少流向甘油的流量。,磷酸解酮酶,丙酮酸脱羧酶,NAD,NADH,乙醇脱氢酶,NAD+,NADH,53,4代谢设计原理,一、在现存代谢途径中改变目的产物代谢流增加目的产物代谢流从以下方面入手：1增加限速酶编码基因的拷贝数没有改变代谢流，只是增加了酶的量，提高了中间物的浓度，从而提高限速反应的反应速率。,54,头孢霉素C的代谢工程菌的构建,克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF,限速步骤,所得转化子头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。,55,4代谢设计原理,2强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率Xanthomonascampestris强化表达黄原胶合成基因3提高目标途径激活因子的合成速率,56,激活因子是生物体内基因表达的开关,它的存在和参与往往能触发基因的正常转录,因此提高激活因子的合成理论上能促进相关基因的表达。在灰色链霉菌中,基因表达顺式元件的激活因子StrR的存在,可以大幅度提高链霉素生物合成途径中链霉胍合成关键酶StrB1的表达,5