无菌操作PPT课件

无菌操作,用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作。如外科手术需防止细菌进入伤口。在各种生物实验中，为了防止微生物的生长和繁殖影响实验的进行，也要在无菌的环境下进行。,无菌操作的要求是:1、操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭。2、操作过程中是界面与外界隔离，避免微生物的侵入,细菌的无菌操作包括：1.细菌的分离培养与接种2.细菌的鉴定做到这些首先来看一下需要的条件：1.细菌实验室2.培养基,细菌的分离培养与接种一、基本条件(1)细菌实验室1、细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染，且室内禁用风扇，避免细菌的播散。2、细菌室必须安装供空气消毒的紫外灯，置于操作台面上一米处，每天工作开始前照射20分钟，对其消毒效国要定期检查，及时更换失效的灯管。,3、室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液溅洒时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆，肥皂及自来水源等。4、室内操作台必须每天用消毒剂檫洗，地面至少一周用消毒剂檫洗一次。,5、对接收的标本，无菌器具，用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6、实验室根据当地的室温特点安装空调机，以适合细菌室工作。同时室内应设置必要的消防设备。,(2)无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰，消毒条件要求更严格。1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应有缓冲区。2.用前以紫外线消毒30分钟，定期用甲醛熏蒸，彻底消毒。3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。,4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应穿隔离衣和专用鞋，操作是戴口罩，随时保证室内的无菌状态。5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的无菌操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6.无菌实验室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。,(3)基本设备和器具细菌实验内必须具备的设备和器具有：用于无菌培养的温箱，二氧化碳培养箱，厌氧培养设备；显微镜，高压蒸汽灭菌器，干烤箱，培养基，接种环，接种针等。,二、培养基培养基是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。,（一）培养基的组成成分,1、营养物质尽管不同的细菌对营养的要求不同，但细菌需要的营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类和生长因子等，常用的营养物质如下：（1）蛋白胨（2）肉浸液（3）牛肉膏（4）糖类、醇类（5）血液（6）无机盐类（7）鸡蛋和动物血清（8）生长因子,2、凝固物质制备固体培养基时，需要在液体中加入凝固物质。最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。,3、抑制剂和指示剂在制备培养基时常加入抑制剂和指示剂，这些并不是细菌生长繁殖所必需的物质，而是由于选择、鉴定及判断结果的需要。（1）抑制剂：抑制剂必须具有选择抑制作用，在制备营养基时加入一定种类的抑制剂，目的在于抑制非检出菌的生长，以利于检出菌的生长。（2）指示剂：在培养基中加入一定种类的指示剂，是为了便于观察细菌是否利用和分解培养基中的糖、醇类。,（二）培养基种类,1、基础培养基2、营养培养基3、鉴别培养基4、选择培养基5、特殊培养基,（三）分离培养基的选择,临床标本送往细菌实验室后，应立即接种到适当的分离培养基上。依据卫生部临床检验中心推荐，细菌实验室应备有如下分离培养基：1、血平板2、巧克力血平板3、中国蓝平板或伊红美蓝平板4、麦康凯平板、琼脂、碱性琼脂或琼脂、血液增菌培养基、营养肉汤,细菌的保存方法与无菌操作,细菌的保存方法1、细菌保存于穿刺培养物中：一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。,2、细菌保存于含有甘油的培养物中：（1）在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇干冰或液氮中冻结后再转至70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37度过夜。,（2）在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，再加入等量的含有30灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库。,菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。保藏方法大致可分为以下几种：,1传代培养保藏法2液体石蜡覆盖保藏法3载体保藏法4寄主保藏法5冷冻保藏法6冷冻干燥保藏法,三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95酒精，10盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0512cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30），液氮冷冻保藏器。,操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点,1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至28的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存24个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。,此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。,2液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，105kg/cm2，1213灭菌30分钟，然后放在40温箱中，使水汽蒸发掉，备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图-12），使菌种与空气隔绝。,（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。,3滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0512cm的小条，装入068cm的安瓿管中，每管12张，塞以棉塞，105kg/cm2，1213灭菌30分钟。（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。（3）取灭菌脱脂牛乳12ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。,（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。（6）将棉花塞入管内，用火焰按图-13熔封，保存于低温下。,（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏1417年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。,4沙土保藏法（1）取河沙加入10稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。,（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。,（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。,（9）于每支沙土管中加入约05ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。,（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。,5液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用7510mm的，或能容12mm液体的。（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，105kg/cm2，1213灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10的甘油蒸馏水溶液或10二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用105kg/cm2，1213灭菌15分钟。,（3）接入菌种将菌种用10的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1的慢速冻结至-30。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。,（5）保藏经冻结至-30的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为150，液态氮内为-196。,（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。,无菌操作注意事项体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而为在一切操作中为最大可能的保证无菌每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。,【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后因物品不全往返拿取而增加污染机会。,【操作和消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。,【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染