第三章-细胞化学染色

.,第三章细胞化学染色,编辑制作何旭春,.,第三章细胞化学染色,细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学，是以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学成分(如酶类、酯类、铁、蛋白质、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。,定义：,第一节概述,.,第三章细胞化学染色,第一节概述,基本步骤,第三章细胞化学染色,固定,显示,复染,.,第三章细胞化学染色,第一节概述,第三章细胞化学染色,固定,物理法,化学法,干燥固定,火焰固定,蒸汽固定,液体固定,.,第一节概述,偶氮偶联法,雪夫反应,联苯胺法,普鲁士蓝反应,金属沉淀法,显示,第三章细胞化学染色,.,第三章细胞化学染色,复染的目的在于使各种细胞能显示出来以便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。,复染,第一节概述,.,临床应用,第一节概述,辅助判断急性白血病的细胞类型,辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断,观察疾病疗效和预后,探讨发病机制,第三章细胞化学染色,.,过氧化物酶染色,酯酶染色,苏丹黑染色,第二节细胞化学染色,第三章细胞化学染色,过碘酸-雪夫反应,中性粒细胞碱性磷酸酶染色,酸性磷酸酶染色,铁染色,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【原理】,POX的染色方法有多种，如复方联苯胺法、二氨基联苯胺法、四甲基联苯胺、改良的pereira染色法等等。二氨基联苯胺染色是临床常用的方法。二氨基联苯胺法：血细胞内的POX，能分解H2O2而释放出新生氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统分化差的早期原始粒细胞为阴性，分化好的晚期原始粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性，且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强；中性分叶核粒细胞呈强阳性，衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性；嗜酸性粒细胞阳性反应最强，嗜碱性粒细胞为阴性。,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统2.单核细胞系统原始单核细胞呈阴性，幼稚及成熟单核细胞多呈弱阳性，其颗粒细少稀疏，分布不均。3.其他细胞淋巴细胞系统、红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞也呈阴性，吞噬细胞有时呈阳性。,.,1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性；3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,临床意义,是辅助判断急性白血病细胞类型的首选、最重要的细胞化学染色,帮助鉴别急性白血病的类型,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【临床意义】,1.帮助鉴别急性白血病的类型（1）POX染色是鉴别急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病的重要指标。急性粒细胞白血病时，原始粒细胞可呈阳性。急性淋巴细胞白血病时，原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞均呈阴性。急性单核细胞白血病时，原始单核细胞、幼稚单核细胞多数呈阴性或弱阳性。,.,急性粒细胞白血病（M2a)的POX染色原始粒细胞均呈阳性,.,急性淋巴细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【临床意义】,1.帮助鉴别急性白血病的类型（2）急性早幼粒细胞白血病有时需与急性单核细胞白血病鉴别，如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性，应确定为急性早幼粒细胞白血病。,.,急性早幼粒细胞白血病的POX染色.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【临床意义】,1.帮助鉴别急性白血病的类型（3）急性单核细胞白血病有时需与组织细胞白血病、恶性组织细胞病相鉴别，异常组织细胞的过氧化物酶呈阴性，而白血病性幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性。,.,急性单核细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性,.,第三章第二节细胞化学染色,一、过氧化物酶（POX）染色,【临床意义】,1.帮助鉴别急性白血病的类型2.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化活性增高：见于再生障碍性贫血、感染、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。活性减低：见于急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征、放射病及退化性中性粒细胞。,.,第三章第二节细胞化学染色,二、苏丹黑（SB）染色,【原理】,苏丹黑是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内的含脂结构（如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇）中，使脂类物质呈棕黑色或深黑色而显示出来。脂类物质在粒细胞中含量丰富，在单核细胞中也有少量。,.,第三章第二节细胞化学染色,二、苏丹黑（SB）染色,【正常血细胞的染色反应】,结果与POX染色基本一致,【临床意义】,与POX染色基本相似,.,三、酯酶染色,根据酯酶特异性高低分为:,特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶),非特异性酯酶,pH值不同,第三章第二节细胞化学染色,酸性酯酶(酸性-醋酸萘酚酯酶),碱性酯酶(-丁酸萘酚酯酶),中性酯酶,-醋酸萘酚酯酶,醋酸AS-D萘酚酯酶,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,.,第三章第二节细胞化学染色,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的呈阳性，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性。嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。2.单核细胞系统绝大多数为阴性。3.其他细胞如淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核红细胞、血小板等均呈阴性；肥大细胞呈阳性。,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.急性粒细胞白血病原始粒细胞呈阳性或阴性。2.急性早幼粒细胞白血病早幼粒细胞呈强阳性。3.急性单核细胞白血病原始单核及幼稚单核细胞几乎呈阴性。4.急性粒-单核细胞白血病原始粒细胞及早幼粒细胞呈阳性，原始单核及幼稚单核细胞呈阴性。5.急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病白血病细胞均呈阴性。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,.,急性粒细胞白血病（M2a）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色1.原始粒细胞，呈弱阳性；2.幼稚粒细胞，呈强阳性；3.中性杆状核粒细胞，呈强阳性,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,血细胞内的-醋酸萘酚酯酶在pH中性的条件下，水解基质液中的-醋酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,1.单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。2.粒细胞系统各期粒细胞多数呈阴性，少数呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,3.淋巴细胞系统各期淋巴细胞多呈阴性，少数呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。4.其他细胞巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.急性单核细胞白血病单核系细胞多呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。2.急性粒细胞白血病原始粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。3.急性早幼粒细胞白血病早幼粒细胞呈强阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,4.急性淋巴细胞白血病原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞呈阴性或阳性，阳性反应不被氟化钠抑制。5.急性粒-单核细胞白血病原始粒细胞呈阴性至阳性，阳性反应不被氟化钠抑制；原始单核及幼稚单核细胞呈阳性，单核系阳性反应能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,.,A图：急性单核细胞白血病-NAE染色原始、幼稚单核细胞多呈强阳性,B图：急性单核细胞白血病-NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）,A,B,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,血细胞内的-NBE在pH碱性条件下，水解基质液中的-丁酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统各阶段粒细胞呈阴性。2.单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。3.淋巴细胞系统T淋巴细胞、非T非B淋巴细胞可呈阳性，B淋巴细胞呈阴性。4.其他细胞巨核细胞、有核红细胞、浆细胞呈阴性或弱阳性；组织细胞也可呈阳性，但不被氟化钠抑制。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】与-NAE染色的临床意义相同。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,血细胞中的酸性-醋酸萘酚酯酶在pH弱酸性(pH5.8)条件下，可水解基质液中的-醋酸萘酚，产生-萘酚，进而与重氮盐六偶氮付品红形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,1.单核细胞系统单核系细胞常呈弥散型强阳性，阳性反应可被氟化钠抑制。2.淋巴细胞系统T淋巴细胞呈阳性，而B淋巴细胞多数呈阴性。3.其他细胞粒系细胞一般为阴性或弱阳性，但此反应不被氟化钠抑制；红系细胞、巨核系细胞含量较少。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.可粗略地鉴别T、B淋巴细胞2.鉴别其它急性白血病细胞类型同-NAE染色。3.多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病细胞多为阳性；恶性组织细胞病呈强阳性；霍奇金淋巴瘤网状高铁红细胞(R-S细胞)呈阳性。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,过碘酸是氧化剂，能使含有乙二醇基（-CHOH-CHOH）的多糖类物质（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖酯等）氧化，形成双醛基（-CHO-CHO），醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使无色的品红变成紫红色化合物，定位于含有多糖类的细胞内。以前又称为糖原染色。,四、过碘酸-雪夫（PAS）反应,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的原始粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性，并随着细胞的成熟而逐渐增强；嗜酸性粒细胞中颗粒之间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞中的嗜碱性颗粒呈阳性。2.红细胞系统有核红细胞及红细胞均呈阴性。3.单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，其他为阳性。,四、过碘酸-雪夫（PAS）反应,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,4.淋巴细胞系统大多数呈阴性，少数呈阳性。5.巨核细胞系统巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应的程度随细胞的发育成熟而增强。6.其他细胞浆细胞一般呈阴性，少数呈阳性，巨噬细胞可为阳性。,四、过碘酸-雪夫（PAS）反应,.,正常血细胞PAS染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（+）3.中性中幼粒细胞（+）4.中性晚幼粒细胞（+）5.中性杆状核粒细胞（+）6.中性分叶核粒细胞（+）7.嗜碱性粒细胞（+）8.嗜酸性粒细胞（+）9.单核细胞（）10.淋巴细胞（+）,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.红细胞系统疾病红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中有核红细胞呈阳性，有时有核红细胞阳性反应强且阳性率高，甚至红细胞也呈阳性。某些红系良性疾病，如严重缺铁性贫血、重型地中海贫血中的有核红细胞也可呈阳性；巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、其他溶血性贫血中的有核红细胞常呈阴性，但有时个别有核红细胞可呈阳性。,四、过碘酸-雪夫（PAS）反应,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,2.白细胞系统疾病急性淋巴细胞白血病时原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞的阳性率升高，阳性反应物质呈粗颗粒状或块状；急性粒细胞白血病时原始粒细胞呈阴性或弱阳性；急性单核细胞白血病时原始单核及幼稚单核细胞可呈阳性；慢性淋巴细胞白血病时淋巴细胞的阳性率增加；恶性淋巴瘤时淋巴瘤细胞阳性率高、阳性强。,四、过碘酸-雪夫（PAS）反应,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.红细胞系统疾病2.白细胞系统疾病3.其他细胞戈谢细胞呈强阳性，尼曼-皮克细胞呈阴性或弱阳性，故PAS染色有助于二者的鉴别；Reed-Sternberg（RS）细胞阴性或弱阳性；骨髓转移性腺癌细胞呈强阳性。,四、过碘酸-雪夫（PAS）反应,.,急性淋巴细胞白血病PAS染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,偶氮偶联法：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。不同的底物与重氮盐的组合不同，其阳性反应物质的颜色可有不同，但其化学反应过程基本相似。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,1.NAP主要存在于中性成熟粒细胞(包括中性杆状核粒细胞和中性分叶核粒细胞)，故中性成熟粒细胞呈阳性反应，其他细胞基本呈阴性。阳性反应表现在胞质中出现棕黑色或棕红色颗粒。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,2.成熟中性粒细胞碱性磷酸酶积分值的计算血涂片经染色后，在油镜下，连续观察100个成熟中性粒细胞，记录其阳性反应细胞所占百分率即为阳性率；并对所有阳性反应细胞逐个按其反应强度作出（+）（+）的分级，将各级所占的百分率乘以级数，然后相加，即为积分值。结果以阳性率和积分值来表示。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,中性粒细胞碱性磷酸酶染色1.中性成熟粒细胞（+）；2.中性成熟粒细胞（+）；3.中性成熟粒细胞（+）；4.中性成熟粒细胞（+）；5.淋巴细胞（-）,.,第三章第二节细胞化学染色,【参考范围】,阳性率40；NAP的积分值为30130分。(各单位应建立本实验室参考值),五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.NAP积分增加见于细菌性感染、类白血病反应、再生障碍性贫血、某些骨髓增殖性疾病、慢性粒细胞白血病加速期或急变期、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移癌等。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,真性红细胞增多症NAP染色1.中性成熟粒细胞（+）；2.中性成熟粒细胞（+）；3.淋巴细胞（-）,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,1.NAP积分增加2.NAP积分下降见于慢性粒细胞白血病慢性期、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,3.疾病的鉴别（1）慢性粒细胞白血病与类白血病反应：前者明显下降且常为零分，后者明显增加。（2）慢性粒细胞白血病(慢性期)与慢性中性粒细胞白血病：前者明显下降，后者明显增加。（3）细菌性感染与病毒性感染：前者明显增加，后者常无明显变化。（4）再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿症：前者常增加，后者常下降。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,3.疾病的鉴别（5）急性白血病类型的鉴别：急性粒细胞白血病常下降，急性淋巴细胞白血病常增加，急性单核细胞白血病一般正常或减低。（6）恶性淋巴瘤与恶性组织细胞病：前者常增加，后者常下降。（7）恶性组织细胞病与反应性组织细胞增多症：前者常下降，后者无明显变化。（8）真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症：前者常增加，后者无明显变化。（9）原发性血小板增多症与继发性血小板增多症：前者常增加，后者无明显变化。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,偶氮偶联法：血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（pH5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,六、酸性磷酸酶（ACP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,Gomori硫化铅法：血细胞内的酸性磷酸酶水解基质液中的-甘油磷酸钠，形成磷酸根，磷酸根与硝酸铅作用生成磷酸铅，定位于胞质中的磷酸铅再与硫化铵反应生成棕黑色硫化铅沉淀。,六、酸性磷酸酶（ACP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,抗酒石酸酸性磷酸酶染色：用相同方法制备两份基质液，一份加入适量的L-酒石酸（左旋酒石酸）,另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸，两张涂片均呈阳性；如不耐L-酒石酸，不加L-酒石酸的涂片呈阳性反应，而加L-酒石酸呈阴性反应。,六、酸性磷酸酶（ACP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性。,六、酸性磷酸酶（ACP）染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【临床意义】,临床ACP染色应用较少，主要用于多毛细胞白血病的诊断及脂质代谢障碍性疾病的鉴别。1.诊断多毛细胞白血病多毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性，但可被L-酒石酸抑制。2.鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞前者阳性，并具有抗酒石酸功能；后者阴性。,六、酸性磷酸酶（ACP）染色,.,多毛细胞白血病酸性磷酸酶染色多毛细胞呈阳性反应,.,第三章第二节细胞化学染色,【原理】,正常人骨髓中的贮存铁以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存，主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。,七、铁染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,骨髓中的贮存铁分为细胞外铁和细胞内铁。细胞外铁主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中，细胞内铁是指存在于中幼红细胞、晚幼红细胞及红细胞中的铁（铁粒幼红细胞、铁粒红细胞）。,七、铁染色,.,第三章第二节细胞化学染色,【正常血细胞的染色反应】,1.细胞外铁观察骨髓小粒中的铁，阳性结果呈弥散性、颗粒状、小珠状或块状蓝色。根据骨髓小粒中铁的存在方式及量，将细胞外铁分为（-）、（+）、（+）、（+）、（+）。,七、铁染色,.,A,骨髓细胞外铁染色A图：细胞外铁+；B图：细胞外铁+,B,.,骨髓细胞外铁