第六讲典型生物催化的反应氧化还原反应PPT课件

.,1,1还原反应,脱氢酶广泛用于醛或者酮等羰基和CC键的还原反应根据底物的取代方式，这两个反应都会由具有不对称潜力的潜手性底物生产手性产物其逆过程（反应）如醇的氧化或者脱氢反应通常会伴随着手性中心的破坏，因而限制了它的应用,.,2,脱氢酶催化的还原反应,.,3,辅酶的再生,氧化还原酶的催化特点氧化还原酶需要氧化还原辅酶，提供（或接受）还原（或氧化）反应中的化学平衡物质。辅酶的类型NAD（H）：80NADP（H）：10黄素（FMN，FAD）和吡咯喹啉醌（PQQ）比较少,.,4,辅酶的特点1、分子相对不稳定2、价格昂贵（化学计量的数量）反应中辅酶仅仅是其氧化还原状态发生变化，因此可以用另外一个氧化还原反应进行原位（insitu）再生。需要加入催化计量的辅酶，降低费用,.,5,辅酶重复利用性能的表征TTN（Totalturnovernumber）总转换数：代表循环过程的效率即：在一个完整的反应过程中每mol辅酶可以产生的产物的总mol数。辅酶分子会在循环过程中受到破坏一般TTN需要达到103104，对于大规模生产，最好能够达到105。,.,6,还原反应技术应用的“瓶颈”辅酶的价格（大规模反应）认识问题深入研究解决问题当使用完整的微生物细胞作用生物催化剂时，辅酶的再生不再是一个关键问题。微生物含有代谢过程中所需的所有酶和辅酶。通过加入象糖类这些廉价易得的氧化还原平衡物质可以进行辅酶的再生。,.,7,还原性尼克酰胺辅酶的再生,1、非酶的化学还原比如用Na2S2O4TTN100，简单，效率较低酶会由于Na2S2O4而引起失活,.,8,2、电化学、光化学再生优点：价格低廉，易于使用缺点：反应区域控制性差，副反应多TTN10003、酶法还原NADH和NADPH高效，复杂，费用高,.,9,酶法还原再生,底物偶联法,.,10,方法：辅酶的再生是通过加入一种辅助底物（Donor，供体），在同一种酶的作用下，向相反的方向进行反应。为使反应平衡向所期望的方向进行，供体通常是过量的，TTN103缺点：1、增加了产物纯化难度2、供体的加入可能引起酶的失活3、辅助底物浓度高，引起底物抑制可以考虑使用气膜等进行反应与分离耦合,.,11,酶偶联法,.,12,方法：两个平行的氧化还原反应，分别由两种不同的酶催化主要底物和辅酶再生的转化过程。特点：两个酶对各自的底物有足够的专一性，使两个酶反应可以各自独立进行。所有的底物和辅助底物不会竞争某一个酶的活性中心，反应效率较高，各自独立进行转化需要加入另外一种酶,.,13,NADH有一些进行再生的好方法，已经获得广泛应用，各有优缺点。NADPH仅在实验室规模进行再生，对于大规模生产尚需开始一种廉价高效的方法,.,14,FDH法：NADH的再生,酶：FormateDehydrogenase,.,15,优点：1、辅助底物和副产物对酶没有抑制作用2、辅助底物和副产物容易和产物进行分离3、FDH有商品酶供应，容易进行固定化，稳定缺点：FDH价格昂贵，比活较低（3U/mg）固定化FDH可以解决上述问题最广泛使用再生NADH的方法TTN：103105，但是不能用于NADPH的再生,.,16,葡萄糖脱氢酶法：NAD(P)H的再生,酶：GDH（Glucosedehydrogenase）,.,17,特点：从Bacilluscereus中提取的GDH很稳定，比活较高缺点：1、GDH价格昂贵2、产物分离困难如果不考虑纯化问题，此法在实验室中应用是一个很好的方法，也是再生NADPH的最简单的方法之一,.,18,G6PDH也可以用于同样的反应体系从Leuconostocmesenteroides肠链球菌中提取的酶廉价，稳定，可以NAD(P)为底物，而酵母中的G6PDH仅以为NADP底物缺点：G6P价格昂贵解决方法：用己糖激酶从葡萄糖利用酶法制取，但是又涉及到ATP的再生,.,19,可以使用6-硫酸-葡萄糖和从酿酒酵母中提取的G6PDH再生NADPH。硫酸不会作为酸催化剂水解NADPH，且底物比磷酸盐容易制备。作为Glucose/GDH方法的补充，是再生NADH和NADPH的比较好的方法,.,20,乙醇脱氢酶和醇脱氢酶法,乙醇脱氢酶（EthanolDH）醇脱氢酶（AlcoholDH）酵母中：NADHL.mesenteroides：NADPH,.,21,广泛用于NADH和NADPH的再生优点：1、ADH价格适中2、乙醇、乙醛有挥发性缺点：1、只有醛或者环酮这样有活性羰基的底物产率较高对其他底物必须加入过量（乙）醇或者不断去除（乙）醛方法：通入氮气，扫除乙醛把乙醛转化为乙酸,.,22,2、TTN较低3、复杂、不稳定的多酶体系4、低浓度的乙醇和乙醛会抑制酶的活力或者引起酶的失活,.,23,氢化酶（Hydrogenaseenzyme）,直接以分子氢作为供体，再生NADH优点：1、还原性强2、不损伤酶和辅酶3、没有副产物缺点：1、对氧化很敏感2、无商品酶3、发酵制备工作复杂,.,24,氧化型尼克酰胺辅酶的再生,最好也是应用最广泛的再生NAD(P)的方法是用谷氨酸脱氢酶(GlutamateDH,GluDH)催化的-酮戊二酸生成L-谷氨酸的反应NADH和NADPH都可以作为辅酶-酮己二酸可作为底物，产物为L-氨基己二酸,.,25,.,26,丙酮酸和乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase）,再生NAD优点：1、LDH价格便宜2、比活较高，比GluDH高缺点：氧化还原势能较低,无法再生NADP,.,27,.,28,乙醛和乙醛脱氢酶,再生NADTTN在103104之间缺点：酶失活优点：1、酵母来源的醛脱氢酶价格便宜2、试剂具有挥发性,.,29,用酶还原醛和酮,许多酮可以用脱氢酶进行立体选择性还原获得手性仲醇产物可能为S醇或者R醇Prelog法则：根据底物的空间结构需要而决定的立体化学反应过程可用一个简单的模型进行判断,.,30,Prelog法则,在Curvulariafalcata细胞进行微生物法还原的立体化学基础上建立脱氢酶主要是从潜手性酮的Re面释放氢大多数商品化的脱氢酶以及大多数微生物在进行酮的立体专一性还原的时候都遵循Prelog法则（如YADH，HLADH）获得到产物为S醇,.,31,Prelog法则示意图,.,32,.,33,各种脱氢酶的底物范围,.,34,酵母醇脱氢酶（YADH）底物专一性范围较窄，一般仅以醛和甲基酮为底物，碳链长于一个甲基的酮不能作为底物其他没有商品酶供应的ADH应用受限制HLADH是一种常见酶，具有广泛的的底物专一性，较好的立体专一性，因此是生物转化中应用最广的脱氢酶,.,35,HLADH由两个几乎相同，各含有两个锌原子的亚基组成的二聚体X衍射对其三维结构研究表明，HLADH的一级结构虽然和YADH相差很大，但是它们的三维结构很相似主要用于对中间单环酮（49个C）和双环酮的还原。大于10个C的环酮不易作为底物，无环酮还原时，对映体选择性较低,.,36,HLADH拆分双、多环酮,.,37,.,38,含N杂环酮会使酶失活，和含锌活性中心发生作用HLADH催化2-烷基噻喃-4-酮的还原反应，转化率可达100，以非对映体选择性方式进行，得到顺，反-S-醇的混合物。后者经色谱分离后再氧化，可以得到光学纯度很高的酮。,.,39,HLADH催化的非对映体还原,.,40,.,41,潜手性萘烷二酮的选择性还原,.,42,YADH和HLADH不能用于开环酮的不对称还原，而TBADH可以还原开环甲基、乙基酮，带杂环取代基的-卤代烷基、甲基或三氟乙基酮，得到相应的仲醇，立体选择性很高,-不饱和酮和取代基大于乙基的酮不能作为底物,.,43,TBADH对映体选择性还原酮,TBADH遵循Prelog法则，得到的是S-醇对于小分子底物，得到的是R-醇,.,44,.,45,TBADH最大的缺陷在于需要NADP(H)作为辅酶NAD(H)V可以代替NADP(H)NAD(H)V用NAD(H)和无机钒酸盐(HVO42-)在溶液中合成由于加入钒酸盐引起的副反应由咪唑缓冲体系来抑制,.,46,.,47,羟基甾体脱氢酶（HSDH）,HSDH适用于还原大型单环和双环酮天然底物为甾体类化合物，类似的空间结构产物可以用Prelog法则判断小分子底物也可以还原，但是选择性就会比较差,.,48,.,49,.,50,从上述酶中选择合适的脱氢酶可以将各种化学合成的酮转化为相应的手性仲醇以NADH作为辅酶的LDH可以将-酮酸还原为R或者S型的羟基酸甘油脱氢酶（GDH），有商品酶。可以用于-羟基酮的立体选择性还原嗜热微生物的研究：酶的稳定性好温度对反应选择性的影响:可供选择范围大,.,51,完整细胞还原醛和酮,和用纯酶进行还原不同，利用完整细胞不需要昂贵的辅酶循环，具有以下优点：1、含有多种可以非天然物质为底物的脱氢酶2、含有所有需要的辅酶3、含有辅酶再生的代谢过程4、可用廉价碳源作为辅助底物5、辅酶、酶的稳定性好,.,52,缺点：1、生产效率低，因为非天然底物的浓度较低（0.10.3左右）2、产物回收困难，特别对于胞内产物3、C源产生大量副产物，少量用于辅酶再生4、反应专一性变化大5、微生物菌种特异性强，重复实验结果难,.,53,课堂作业:请描述酶法制备S-2-氯丙酸联产S-乳酸过程所用的原料名称和酶,.,54,微生物还原的选择性差的原因,只有一种氧化还原酶催化还原反应，但是手性识别能力不高两种或者两种以上氧化还原酶可以还原底物不同的异构体，产生选择的竞争性反应的选择性取决于各个反应的相对反应速率米氏方程，Vmax/Ks,.,55,改善微生物还原反应选择性的方法,加反应后可除去的保护基团修饰底物通过固定化技术改变代谢参数用不同生长阶段的细胞改变发酵条件筛选更好的微生物选择性抑制竞争酶的酶活,.,56,酵母细胞还原醛和酮,面包酵母（BakersYeast）或酿酒酵母应用最广泛的进行酮不对称还原的微生物来源广，不需要无菌发酵，设备要求低用于生物转化历史悠久，可供参考文献多还原简单的脂肪醇和芳香醇遵循Prelog法则获得S-醇除了长链甲基酮，其他长链酮不能作为底物,.,57,带有氯、溴、氟、硝基、羟基和甲硅烷基等基团的酮也可以作为底物,.,58,.,59,.,60,脂肪族-酮酯被酵母还原产生-羟酯,.,61,.,62,反应产生分歧的原因不是单酶底物选择性根据底物结构不同而发生了变化，主要是有一系列不同的脱氢酶，对同一种底物产生竞争，从而具有不同的立体选择性D专一性酶（属于脂肪酸复合酶系）对短链醇基的底物更具亲和性，如甲酯L专一性酶对长链醇基的底物更具亲和性，比如辛酯,.,63,因此可以通过仔细设计底物来调节控制反应的选择性选择性抑制其中一种竞争性的酶其他方法，比如固定化,.,64,选择性抑制L型酶,.,65,选择性抑制D型酶,.,66,酵母还原-单取代-酮酯,还原后产生顺/反-羟酯顺/反不是1:1，烯醇化引起快速原位消旋非对映体选择性由酶的立体选择性决定，动力学拆分过程取代基较小时，主要为顺式（Syn）取代基较大时，主要为反式（Anti）,.,67,.,68,a:获得的是2R,3R-Syn和2S,3R-anti,.,69,羰基还原产生的仲醇手性遵循Prelog法则模型预测：非对映体选择性1、-取代基小于羧基部分，进入S-取代基大于羧基部分，进入L2、酵母中存在多种脱氢酶，可以获得各种可能的非对映体产物-取代基为羟基、硫代烷基、叠氮基、乙酰氨基或者位完全取代时，不利于发生烯醇异构化，不能原位消旋,.,70,.,71,环状酮酯的还原,根据上述模型，可以推测酵母还原-环酮获得相应的顺式-羟酯。原因在于环状结构的刚性，使、-碳碳键不能旋转因此环酮还原反应的对映体选择性比无环酮要高环结构中引入S，生物转化后再除去，增加对映体选择性,.,72,.,73,.,74,用相同方法可以将-酮酯，-酮酰胺转化为相应的-羟基衍生物根据Prelog法则，利用酵母作为催化剂，可以将丙酮酸盐和-酮苯乙酸酯转化为高光学纯度（e.e.为91100）的S-乳酸盐和R-扁桃酸酯,.,75,环状-双酮,还原产物为-羟基酮，而不会产生双羟基碳上的H具有酸性，可能会导致底物和乙醛发生缩合反应。所以可在此处用取代基进行取代，以避免这一副反应对于小环，顺式产物占优势，光学纯度高环变大时，立体选择性比较难以预测，产率会下降,.,76,.,77,.,78,酵母还可以用于还原带有硝基、氟、硫和杂环功能化合物的还原，以及金属有机化合物的还原。产物一般是S-醇很多成功的实例，有些已经工业化除了酵母外，当酵母催化的反应立体选择性较低，或者产生的产物与所需构型相反，则可以考虑用其他微生物进行催化,.,79,无环-双酮的还原,生产二醇首先是空间位阻较小的羰基被还原为S-羟基酮（Prelog法则）然后是空间位阻较大的酮被进一步还原，产生二醇，主要产物为反式二醇,.,80,.,81,.,82,完整细胞还原CC键,酶立体选择性催化还原潜手性CC双键具有较高的专一性，可用于很广的底物范围，一般来说是用传统化学方法很难实现的酶：以NADH为辅酶的烯酸还原酶很多微生物中都存在，比如Clostridia，Proteussp.以及酵母中,.,83,烯酸还原酶已经被分离纯化和鉴定制备性生物转化还是利用完整细胞，因为存在辅酶再生的问题，同时烯酸还原酶对痕量氧很敏感酶反应的立体化学过程：氢反式加成在CC双键上（植物细胞中有顺式加成）,.,84,酵母细胞不对称还原CC双键,1934年发现面包酵母可以不对称还原CC建立了一套面包酵母对CC不对称还原的作用规律，有时可以用于其他微生物C=C需经吸电子取代基团活化以后才能被还原，单独的CC和碳碳三键无法被还原具体的活化基团见随后的具体例子,.,85,-不饱和碳酸和酯的还原,产物的绝对构型可以通过起始烯烃的顺反异构体（E，Z）来控制一般是酯先被水解为相应的酸，然后再被还原,-不饱和内酯也可以作为还原底物，产物为R型,.,86,.,87,.,88,不饱和内酯,.,89,.,90,-不饱和醛的还原,首先CC被烯酸还原酶还原生产饱和醛饱和醛被脱氢酶还原得到手性链烷醇烯丙醇也可以作为底物,.,91,共扼二烯中只有,双键被选择性还原,.,92,-不饱和酮的还原,CC首先被还原，得到饱和酮然后被脱氢酶还原产生手性仲醇有些时候，吸电子基团活化的不饱和酮首先被还原,-不饱和硝基化合物可被转化为手性硝基烷烃，但是光学纯度不高,.,93,.,94,.,95,全细胞体系的辅酶再生技术,可以避免辅助底物产物不需要的代谢物将不可降解的有机染料分子用于电子传递的中间体提高反应速率，相当于加入了辅酶中间体的还原形式可以直接或者间接再生NADH氧化型中间体可以用廉价还原物质酶法再生再生所需酶微生物体内都具备,.,96,课堂作业:请描述酶法制备S-2-氯丙酸联产S-乳酸过程所用的原料名称和酶,.,97,2氧化反应,氧化反应是向有机分子引入功能基团的重要反应化学方法立体选择性差，副反应多，环境污染严重生物法一般具有较好的立体选择性,.,98,醇和醛的氧化,酶：氧化酶，加氧酶脱氢酶一般不用于氧化反应1、热力学上来说，醇的氧化反应比较困难氧化型辅酶的再生也比较困难2、产物抑制严重，醛、酮和酶结合比较紧密3、酶氧化反应最佳pH一般为89，而此时辅酶和产物（尤其是醛）是不稳定的4、仲醇的氧化一般涉及到手性中心的破坏,.,99,多元醇的区域选择性氧化,酶催化醇的氧化反应只有涉及到复杂分子如多元醇才具有实际意义传统方法氧化这些物质存在选择性问题，涉及到羟基的一系列保护和去保护步骤各种微生物，如Acetobaoter或Pseudomonas等可以一步反应就将多羟基化合物选择性氧化为相应的酮醇或者酮酸,.,100,.,101,醇的氧化拆分,理论转化率100,.,102,用HLADH进行对映体的选择性氧化,R=-CH2OH,-CH2F,-CH2Cl,-CH2Br,-CH3,-CH2NH2,-CH=CH2,-CH2CH3,.,103,用HLADH进行对映体的选择性氧化，从而进行醇的拆分主要困难在于NAD的再生FMN再生体系可以用于HLADH对单、双、多环仲醇的拆分为避免酶的失活，过程中产生的过氧化氢可用过氧化氢酶去除醇氧化为醛，继而氧化为酸,.,104,不对称氧化潜手性或者内消旋二醇,仲醇的拆分一般用酯酶代替上述氧化还原反应潜手性或内消旋结构的二醇的不对称反应是合成手性内酯的好方法HLADH一般选择性氧化S或者潜手性S羟基存在自发形成半缩醛的反应,.,105,.,106,S型，高选择性，e.e.100,.,107,.,108,HLADH对双环内消旋二醇的拆分,.,109,总的来说，HLADH对连接S-中心的羟甲基具有完全的对映体专一性经HLADH催化，先生成的羟醛变成半缩醛，然后被进一步氧化产生内酯仅在双环辛烷体系中有少量中间体半缩醛存在,.,110,加氧反应,直接催化分子氧进入有机分子的酶称为加氧酶非活性有机底物的直接加氧官能团反应对合成化学来说有很多难以解决的问题酶催化加氧反应就比较容易进行反应尤其是存在区域选择性或者对映体专一性的要求时，用生物催化可以实现高选择性的加氧反应,.,111,氧进入有机受体分子的机制,.,112,单加氧酶的作用下，以NADH或者NADPH作为辅酶，形成H2O，一分子氧加到底物上双加氧酶直接将氧分子加到底物上，因此有时也称为氧转移酶氧化酶涉及到氧上面的电子传递，可以是传递2个或者4个电子，形成过氧化氢或者水包括：黄素蛋白氧化酶（如葡萄糖氧化酶）金属黄素氧化酶（如醛氧化酶）亚铁蛋白氧化酶（如过氧化氢酶）,.,113,单加氧酶,单加氧酶的反应机理根据酶底物的种类不同而有不同，但他们激活氧的方式是一样的分子氧被还原剂如NADH，NADPH的还原过程所激活，其中一个氧转移到底物上，另一个还原形成H2O