分子标记辅助育种.ppt

2020/5/1,278,1,分子标记辅助选择育种主讲人：洪德林教授南京农业大学农学院2014年8月25日南13851532991delinhong,2020/5/1,278,2,内容：一、分子标记辅助选择的含义和意义二、分子标记的类型三、重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术四、作物MAS育种,2020/5/1,278,3,一、分子标记辅助选择的含义和意义选择是指从一个育种群体中挑出符合要求的目标基因型。传统育种是通过目标性状的表现型对基因型进行间接选择。分子标记辅助选择（Marker-assistedselection,MAS)是利用与目标性状基因紧密连锁的标记对基因型进行间接选择。,2020/5/1,278,4,传统育种主要依赖对植株的表现型选择（phenotypicselection）。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。,2020/5/1,278,5,例如抗病性的鉴定就受发病条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作就更困难。一个优良品种的培育往往需花费78年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。,2020/5/1,278,6,育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。,2020/5/1,278,7,以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外源基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。,2020/5/1,278,8,生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异，已在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。,2020/5/1,278,9,以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析、品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecularmarker-assistedselection,MAS)育种更受到人们的重视。,2020/5/1,278,10,与传统的表现型选择相比，MAS的优点：1、不受等位基因间显隐性关系、其他基因效应和环境因素的影响，选择结果可靠。,2020/5/1,278,11,2、可在植株生长发育前期和育种早代时期进行选择，提高选择效率和缩短育种年限。(意义：省钱省时）,2020/5/1,278,12,（一）分子标记辅助选择的基本原理首先，通过基因定位或QTL分析，获得与目标性状基因或QTL连锁的分子标记。（什么是遗传标记？）,2020/5/1,278,13,图1引物RM5629对5个杂交组合F1及其亲本的扩增带型1=863A；2=863B；3=86优8；4=宁恢8号,5=9522A；6=9522B；7=常优1号；8=R254；9=六千辛A；10=六千辛B；11=六优一号；12=77302-1；13=泗稻8号A；14=泗稻8号B；15=泗优422；16=LH422；17=03A；18=03B；19=3优18；20=C418.M：梯度为100bp的DNA大小标记,2020/5/1,278,14,图1用SSR引物JESPR-110，扩增棉花P1、P2、F1及158个BC1F1单株总DNA的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图注：M为100bpladder的Marker，P1为T586，P2为T582。,2020/5/1,278,15,2020/5/1,278,16,办法是：通过构建包含目标性状分离群体（F2群体、BC1F1群体、DH群体或RIL群体、BIL群体）和连锁分析，获得与目标性状基因连锁的共显性分子标记。,2020/5/1,278,17,基于PCR技术的分子标记，如SSR标记、SCAR标记、CAPS标记、STS标记等，是较理想的适用于辅助选择的分子标记。,2020/5/1,278,18,2.,2020/5/1,278,19,（,2020/5/1,278,20,2.,2020/5/1,278,21,2.,2020/5/1,278,22,2.,2020/5/1,278,23,2.,2020/5/1,278,24,然后，利用分子标记对目标基因型进行辅助选择。这是通过对分子标记基因型的检测间接选择目标基因型。分子标记与目标基因的连锁越紧密，选择效率越高。,2020/5/1,278,25,有研究表明，若要选择效率达90%以上，则标记与目标基因间的重组率必须小于0.05。同时用两侧相邻的两个标记对对目标基因进行选择,可大大提高选择的准确性。,2020/5/1,278,26,在回交育种程序中，除了对目标基因进行正向选择（前景选择）外，还可同时对轮回亲本的遗传背景进行选择（背景选择）。,2020/5/1,278,27,2020/5/1,278,28,（二）不同目标性状类型的分子标记辅助选择效率对于质量性状：在多数情况下，没有必要借助分子标记辅助。但在以下几种情况下，利用标记辅助选择可提高选择效率。,2020/5/1,278,29,表现型测定在技术上难度较大或费用很高，如抗病虫性。举例：玉米矮缩病，病毒不能通过卵子传递，抗病鉴定难度大。,2020/5/1,278,30,2020/5/1,278,31,2020/5/1,278,32,表现型只在个体发育后期才能测量。如籽粒蛋白含量。,2020/5/1,278,33,目标性状由隐性基因控制，在杂合世代不表现。回交转育过程中，还需同时对背景进行选择。,2020/5/1,278,34,对于多基因控制的数量性状：对多基因选择不但技术上更复杂，成本更高，而且由于每个QTL的贡献率较小，效率也更低。,2020/5/1,278,35,尽管如此，一旦建立起QTL与分子标记的连锁关系，就有希望利用MAS进行改良。,2020/5/1,278,36,借助分子标记对QTL进行辅助选择的成败主要取决于对QTL的精确定位以及QTL受环境因素和其他基因型影响的大小。,2020/5/1,278,37,目前对QTL的分析在相当大的程度上还是建立在样本较小、实验精确性较低、统计分析未考虑上位性效应的基础上，仍需完善方法及其应用软件，从而更精确地估计QTL对表现型的贡献率。,2020/5/1,278,38,二、分子标记的类型,2020/5/1,278,39,按技术特性，分子标记可分为四大类。第一类是以DNA分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记（restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP标记）。（第一代，20世纪70年代发现，1980用于构建人类连锁图）。,2020/5/1,278,40,1RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶（restrictionenzymes，RE）酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。,2020/5/1,278,41,对每一个DNA/RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。,2020/5/1,278,42,某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离。然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,2020/5/1,278,43,用放射性同位素（如P32）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交（即Southern杂交）。若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。,2020/5/1,278,44,放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况（图17-2）。,2020/5/1,278,45,图17-2RFLP分析流程图,2020/5/1,278,46,对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。,2020/5/1,278,47,RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辩的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆，植物基因组克隆（randomgenome克隆，简称RG克隆）和PCR克隆。,2020/5/1,278,48,2RFLP标记的特点RFLP标记具有共显性的特点。共显性（co-dominant）标记指的是来源于双亲的同一基因位点产生两个以上分子量不同的多态性片段，均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。,2020/5/1,278,49,RFLP标记所需DNA量大（515ug），检测步骤比较繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素（通常为P32），易造成污染。,2020/5/1,278,50,尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们一直致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于在育种上利用。,2020/5/1,278,51,第二类是以聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）为基础的各种DNA指纹技术。这是目前普遍使用的一类分子标记，也是与分子标记辅助选择育种结合最紧密的分子标记。（第二代，1990年）,2020/5/1,278,52,PCR是Mullis等（1985）首创的在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。,2020/5/1,278,53,PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性（denaturation）、复性（annealling）、延伸（extension）三步（图17-1）。,2020/5/1,278,54,图17-1PCR扩增原理图,2020/5/1,278,55,变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；,2020/5/1,278,56,复性（又称退火）是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链;,2020/5/1,278,57,延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5-3的DNA链延伸。,2020/5/1,278,58,以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经2530个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2106-7拷贝。,2020/5/1,278,59,按照PCR所需引物类型又可分为：（一）单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记（randomamplificationpolymorphismDNA，RAPD）、简单重复序列中间区域标记(inter-simplesequencerepeatspolymorphisms，ISSR)等技术；,2020/5/1,278,60,1RAPD标记的原理Williams等（1990）以DNA聚合酶链式反应为基础而提出。所谓RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（长度为10个核苷酸）通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。,2020/5/1,278,61,RAPD标记的原理同PCR技术，但又有别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：（1）引物：常规的PCR反应所用的是一对引物，长度通常为20bp（碱基对）左右；RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp；,2020/5/1,278,62,（2）反应条件：常规的PCR复性温度较高，一般为5560，而RAPD的复性温度仅为36左右；,2020/5/1,278,63,（3）扩增产物：常规PCR产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。,2020/5/1,278,64,RAPD反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。,2020/5/1,278,65,2RAPD标记的特点如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插入，缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。,2020/5/1,278,66,若PCR产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标记，通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。,2020/5/1,278,67,RAPD标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性标记指的是F1的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为“有/无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。,2020/5/1,278,68,RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。,2020/5/1,278,69,由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探针制备，同位素标记，Southern印迹等步骤，分析速度很快。,2020/5/1,278,70,RAPD分析所需DNA样品量少（一般510ng），对DNA质量要求较RFLP低。同时，RAPD标记还可转化为RFLP探针、SCAR及STS等表现为共显性和显性的分子标记。,2020/5/1,278,71,RAPD最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg2+浓度等。目前这类标记已很少采用。,2020/5/1,278,72,Euphytica,2003,129(2):249-252,2020/5/1,278,73,Euphytica,2003,129(2):249-252,2020/5/1,278,74,Euphytica,2003,129(2):249-252,2020/5/1,278,75,SCAR标记在RAPD技术的基础上，1993年，Paran等提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。它的基本原理是：,2020/5/1,278,76,目标DNA经RAPD分析后，将RAPD多态片段从凝胶上回收，并连接到载体上。由于Taq酶可使PCR产物3末端带上A尾巴，人工设计的克隆载体5末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。,2020/5/1,278,77,筛选含克隆片段的载体进行两端测序，根据测序结果设计长为1824bp的PCR引物，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效地用于分子标记辅助选择育种研究。,2020/5/1,278,78,M,1,2,3,1,2,3,21:II-32A4,5,6,22:II-32B7-12,23-24:珍汕97A13-15,25:珍汕97B16-17,26:珍品A18-20,27:珍品B,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,17,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,1000bp,RiceScience,2013,20(3):191199,2020/5/1,278,79,（二）需要通过克隆，测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记（simplesequencerepeats，SSR）、序列特征化扩增区域（sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR技术）和序标位（sequence-taggedsites，STS）等。,2020/5/1,278,80,SSR标记1987年，Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，他们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR（variablenumbertandemrepeat）。,2020/5/1,278,81,VNTR标记包括小卫星（minisatellites）和微卫星（microsatellites）标记两种。微卫星标记，即SSR标记，是一类由16个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置（图17-4）。,2020/5/1,278,82,图17-4微卫星标记检测示意图箭头所示位置为SSR两侧的引物序列,2020/5/1,278,83,如（GA）n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重复，其中n代表重复次数，其大小在1060之间。这类序列的重复长度具有高度变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组研究。目前已在植物基因组研究当中广泛使用。,2020/5/1,278,84,1SSR标记的原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。,2020/5/1,278,85,2.,2020/5/1,278,86,2.,2020/5/1,278,87,2.,2020/5/1,278,88,2.,2020/5/1,278,89,2.,2020/5/1,278,90,2.,2020/5/1,278,91,2.,2020/5/1,278,92,2.,2020/5/1,278,93,同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。,2020/5/1,278,94,基于基因组序列建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般程序（图17-4）如下：1）建立基因组DNA的质粒文库。,2020/5/1,278,95,（2）根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲获得(AT)n/(TA)nSSR则可合成G(AT)n作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆。,2020/5/1,278,96,（3）对阳性克隆DNA插入序列测序；（4）根据SSR两侧序列设计并合成引物；,2020/5/1,278,97,（5）以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；（6）高浓度琼脂糖凝胶，非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。,2020/5/1,278,98,EST（expressedsequencetag，表达序列标签）是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体上，构建成cDNA文库后，随机挑选cDNA克隆，对其5或3端进行大规模单向自动测序所获得的序列片段，一般有150600bp。这些序列代表了mRNA序列的一部分，也代表了相应基因的表达情况。,2020/5/1,278,99,近年来，在许多作物上开展了大规模的cDNA单边测序，其序列信息已在网上公开释放，从这些EST序列中开发出大量的SSR标记用于分析。大大降低了SSR标记的开发成本，增强了该标记的应用潜力。,2020/5/1,278,100,目前，SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建，品种指纹图谱绘制及品种纯度检测，以及目标性状基因标记等研究领域。,2020/5/1,278,101,2SSR标记的特点SSR的检测是依据其两侧特定的引物进行PCR扩增，因此是基于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。,2020/5/1,278,102,SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提高分辩力，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，它可检测出单拷贝差异。它兼具PCR反应的优点，所需DNA样品量少，对DNA质量要求不太高。,2020/5/1,278,103,3ISSR标记在SSR标记的基础上开发的ISSR（inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNA）分子标记是用两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间单拷贝序列，通过电泳检测其扩增产物的多态性。,2020/5/1,278,104,引物设计采用二个核苷酸、三个核苷酸或四个核苷酸序列为基元（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物，从而保证引物与基因组DNA中SSR的5或3末端结合，通过PCR反应扩增两个SSR之间的DNA片段。如(AC)nX，(TG)nX，(ATG)nX，(CTC)nX，(GAA)nX等（X代表非重复的锚定碱基）。,2020/5/1,278,105,Naganka等（1997）已在小麦的ISSR标记研究中发现ISSR标记可获得数倍于RAPD标记的信息量。由于ISSR标记检测步骤简单，针对重复序列含量高的物种，利用ISSR法开展研究可与RFLP，RAPD等分子标记相媲美。它对填充遗传连锁图上大的不饱和区段，富集有用的理想标记具有重要意义。,2020/5/1,278,106,第三类是结合分子杂交和PCR扩增开发的分子标记，如扩增片段长度多态性标记（amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP）；扩增切割多态性标记(cleavedamplifiedpolymorphicsequence,CAPS)。,2020/5/1,278,107,AFLP标记它是荷兰Keygene公司科学家Marc和Pieter1993年创造发明的一种分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。,2020/5/1,278,108,1AFLP标记的原理首先对基因组DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶（frequentcutter），另一种为酶切频率较低的酶（rarecutter）。,2020/5/1,278,109,用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易于扩增的，且可在测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA片段的数量。,2020/5/1,278,110,AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制性内切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。,2020/5/1,278,111,将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为下一步PCR反应的引物结合位点。,2020/5/1,278,112,通过设计在末端上分别添加13个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增。最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP的原理示意图见图17-3。,2020/5/1,278,113,2020/5/1,278,114,AFLP分析的基本步骤可以概括为：（1）将基因组DNA同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，在这些DNA片段两端连接上特定的寡核苷酸接头（oligonucleotideadapters）。,2020/5/1,278,115,（2）通过接头序列和PCR引物3末端的识别，对限制性片段进行选择扩增。一般PCR引物用同位素P32或P33标记。,2020/5/1,278,116,（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。,2020/5/1,278,117,（4）将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理。,2020/5/1,278,118,（5）在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。,2020/5/1,278,119,2AFLP标记的特点AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动、植物的基因组研究。,2020/5/1,278,120,AFLP多态性远远超过其它分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50100条AFLP扩增产物，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，是多态性最丰富的一种标记技术。,2020/5/1,278,121,AFLP标记多数具有共显性表达，无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。该技术受专利保护，同时对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这是它的不足之处。,2020/5/1,278,122,CAPS标记用特异设计的PCR引物与限制性内切酶酶切相结合而产生的一种DNA标记。,2020/5/1,278,123,当PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变，插入或缺失数很小，以至无多态性出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性（Akopyanz等，1992），该检测方法即为CAPs技术。,2020/5/1,278,124,其基本步骤是：先利用特定引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，溴化乙锭（EB）染色，观察其多态性。,2020/5/1,278,125,与RFLP技术一样，CAPs技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。CAPs作为一种分子标记，有以下几个优点：（1）引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析；,2020/5/1,278,126,（2）在真核生物中，CAPs标记呈共显性；（3）所需DNA量少；（4）结果稳定可靠；（5）操作简便、快捷、自动化程度高。,2020/5/1,278,127,CAPs标记最成功的应用是构建拟南芥遗传图谱。Konieczny等（1993）将RFLP探针两端测序，合成PCR引物，在拟南芥基因组DNA中进行扩增，之后用一系列4碱基识别序列的限制性内切酶酶切扩增产物，产生了很多CAPs标记，进一步将这些CAPs标记定位在相应染色体上并构建了遗传图谱。,2020/5/1,278,128,目前，CAPs标记在二倍体植物和多倍体植物研究中均发挥着巨大作用，是PCR标记的有力补充。其不足之处在于CAPs标记须使用内切酶，这增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。,2020/5/1,278,129,第四类是以DNA测序为基础的分子标记，如单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。,2020/5/1,278,130,SNP标记SNP即单核甘酸多态性，是指单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。它包括单碱基的转换，颠换、插入及缺失等形式。在遗传学分析中，SNP作为一类遗传标记得以广泛应用。,2020/5/1,278,131,SNP标记主要特点：（1）分布广泛，密度高。SNP在人类基因组的平均密度估计为1/1000bp，在整个基因组的分布达3106个，遗传距离为23cM，密度比SSR更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。,2020/5/1,278,132,（2）富有代表性，某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此，它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。,2020/5/1,278,133,（3）检测方便。在对基因组筛选时往往只需对SNP进行扩增产物有无的分析，而无须进行DNA片段的长度分析，这就有利于发展高通量、自动化的基因型分析系统。,2020/5/1,278,134,（4）遗传稳定性高。与SSR相比，SNP具有更高的遗传稳定性。,2020/5/1,278,135,SNP本身的特点使其具备其他分子标记无可比拟的优越性，成为继RFLP，SSR后的第三代分子标记。目前，基于SNP开发特异PCR引物的SNAP标记（图17-5）和基于限制性酶切的CAPs标记是检测SNP的常规手段。,2020/5/1,278,136,图17-5SNAP原理图P1代表亲本1，P2代表亲本2；F1代表根据亲本1设计的SNAP的前引物，方向5-3；F2代表根据亲本2设计的SNAP的前引物，方向5-3；R代表反向引物，亲本1和亲本2公用，方向3-5。A图：亲本序列比对结果及SNAP引物设计的位置。B图：引物F1与亲本1结合可以产生扩增产物；而与亲本2在3端不结合，不能产生扩增产物；相反，引物F2与亲本2结合可以产生扩增产物，而与亲本1在3端不结合，不能产生扩增产物。C图：利用两对引物在两亲本中的扩增产物电泳模式图。,2020/5/1,278,137,其他标记STSSTS是序列标签位点或序标位的简称。它是指基因组中长度为200500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。,2020/5/1,278,138,1989年，华盛顿大学的Olson等人利用STS单拷贝序列作为染色体特异的界标（landmark），即利用不同STS的排列顺序和它们之间的间隔距离构成STS图谱，作为该物种的染色体框架图（frameworkmap）。,2020/5/1,278,139,框架图对基因组研究、新基因的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。STS引物的获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列和EST序列。,2020/5/1,278,140,STS标记表现共显性遗传，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，是遗传图谱和物理图谱转化的桥梁，很有实用价值。,2020/5/1,278,141,但是，与SSR标记一样，STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，相比其它标记，仍显成本较高。目前，许多作物中已开始收集STS信息，并建立起相应的信息库，以便于国际同行随时调用。,2020/5/1,278,142,分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：1）表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；2）数量多，理论上遍及整个基因组；,2020/5/1,278,143,3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；4）对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；,2020/5/1,278,144,5）部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；6）成本不是太高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。,2020/5/1,278,145,应用于MAS育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表17-1。,2020/5/1,278,146,三、重要农艺性状基因/QTL的标记定位目标基因的标记筛选（genetagging）是进行MAS育种的基础。用于MAS育种的分子标记需具备3个条件：,2020/5/1,278,147,1）用于基因选择的分子标记具有真实性。标记与目标基因应紧密连锁（5cM），最好使用两侧标记或基因本身的标记；,2020/5/1,278,148,2）标记检测方便，适用性强，重复性好。所用标记应对模板DNA的质量和数量要求不太严格，最好是以PCR为基础的分子标记，能经济简便地检测大量个体；,2020/5/1,278,149,3）不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需要有亲本基因型的分子标记研究基础。,2020/5/1,278,150,（一）遗传图谱的构建遗传图谱构建是重要农艺性状基因/QTL的标记和定位、基因的图位克隆、比较作图以及MAS育种等的基础。,2020/5/1,278,151,由于分子标记数目的限制，目前选用作图亲本时，一般首先考虑亲本间的多态性水平，而对育种目标性状基因的标记定位考虑得较少。选用两个差异极大的品种（品系或种质系），甚至不同的种间材料创造分离群体，可获得较饱和的遗传图谱，但也容易使遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记筛选割裂开来。,2020/5/1,278,152,遗传作图的原理与经典连锁测验一致，即基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合；而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期因非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组。,2020/5/1,278,153,用重组率来表示基因间的遗传距离，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，一个cM的大小大致符合1%的重组率。遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反映DNA的实际长度。,2020/5/1,278,154,遗传图谱构建的主要环节为：（1）根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体；（2）分离群体中不同个体的标记基因型分析；（3）借助计算机程序构建连锁群。,2020/5/1,278,155,要构建好的遗传图谱，首先应选择合适的亲本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易程度，遗传图谱的准确性及所建图谱的适用性。亲本间的差异不宜过大，否则会降低后代的结实率及所建图谱的准确度。,2020/5/1,278,156,而亲本间适度的差异范围因不同物种而异，通常多态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂交亲本，而多态性低的自交作物则需选择不同种间或亚种间品种作杂交亲本。,2020/5/1,278,157,如玉米的多态性极好，一般品种间配制的群体就可成为理想的分子标记作图群体，而番茄的多态性较差，因而选用不同种间杂种后代构建分子标记作图群体。自花授粉作物与异花授粉作物作图群体的构建方法见图17-6。,2020/5/1,278,158,自花或常异花授粉作物作图群体的构建方法：P1P2F1F1P1F1F2BC1F1F3RILBILDHL,花培,自交,2020/5/1,278,159,用于分子标记的遗传作图群体一般分为两类，一类为暂时性分离群体，包括F2群体，BC等；另一类为重组自交系群体（recombinantinbredlines，RIL）或加倍单倍体（doubledhaploid，DH）等永久性分离群体。它们的特点见表17-2。,2020/5/1,278,160,F2群体构建比较省时，但由于每个F2单株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了该群体的作图能力。,2020/5/1,278,161,BC群体是由F1与亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较为简单，但提供的信息量少于F2群体，且可供作图的材料有限，不能多代使用。,2020/5/1,278,162,通过远缘杂交构建的F2作图群体，易发生向两极疯狂分离，标记比例易偏离3：1或1：2：1，这类种间杂交群体往往利用BC群体。,2020/5/1,278,163,RIL群体是由F2经多代自交一粒传（SSD）方法获得的，基因组相对纯合。RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同实验室的协同研究，而且作图的准确度更高。缺点是建立RIL群体相当费时，而且有的物种很难产生RIL群体。,2020/5/1,278,164,DH群体是通过对F1进行花药离体培养或通过特殊技术（如棉花的半配生殖材料）得到单倍体植株，再经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体。因此DH群体也能够长期保存。但构建DH群体需深厚的组织培养基础和染色体加倍技术。,2020/5/1,278,165,与暂时性群体相比，永久性群体至少有两方面长处：（1）群体中各品系的遗传组成相对固定，可以通过种子繁殖代代相传，不断地增加新的遗传标记，并可在不同的研究小组之间共享信息；（2）可以进行多点重复试验。这对某些病害的抗性鉴定以及受多基因控制且易受环境影响的数量性状的分析尤为重要。,2020/5/1,278,166,(二)质量性状基因的分子标记筛选,2020/5/1,278,167,许多重要的农艺性状，如抗虫性，育性，一些抗病、抗逆性状（抗盐、抗旱）等表现为质量性状遗传的特点。,2020/5/1,278,168,由于这些性状只受单基因或少数几个显性或隐性主基因控制，在分离世代无法通过表型来识别目的基因位点是纯合还是杂合，在几对基因作用相同时（如一些抗病基因对病菌的不同生理小种反应不同），无法识别哪些基因在起作用。,2020/5/1,278,169,特别是一些质量性状虽然受少数主基因控制，但其中许多性状的表现还受遗传背景，微效基因以及环境条件的影响。所以利用分子标记技术来定位、识别质量性状基因，特别是利用分子标记对一些易受环境影响的抗性基因的选择就变得相对简单。,2020/5/1,278,170,暂时性的和永久性分离群体都广泛用于质量性状遗传基因的分子标记筛选。,2020/5/1,278,171,1.近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记近等基因系（NIL）是Young等人最早提出来的。近等基因系的培育主要是通过多次的定向回交，它与原来的轮回亲本就构成了一对近等基因系（图17-7a）。,2020/5/1,278,172,图17-7NIL和BSA法分析(a)近等基因型的创建(b)F2极端群体的分离(c)近等基因系和群体分组分析两种方法的分子标记分析（1995,Tanksley等）,2020/5/1,278,173,在回交导入目标性状基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将随之进入回交子代中。NIL作图的基本思路是通过鉴别位于导入的目标基因附近连锁区内的分子标记，借助于分子标记定位目标基因。,2020/5/1,278,174,利用这样的品系可在不需要完整遗传图谱的情况下，先用一对近等基因系筛选与目标基因连锁的分子标记，再用近等基因系间的杂交分离群体进行标记与目的基因连锁验证，从而筛选出与目标基因连锁的分子标记。NIL分析方法见图17-7c。,2020/5/1,278,175,图17-7NIL和BSA法分析(a)近等基因型的创建(b)F2极端群体的分离(c)近等基因系和群体分组分析两种方法的分子标记分析（1995,Tanksley等）,2020/5/1,278,176,Param等运用212个随机引物对莴苣抗、感霜霉病（Dm）的近等基因系进行了RAPD分析，将4个RAPD标记定位在Dm1和Dm3连锁区域，6个定位在Dm11连锁区。,2020/5/1,278,177,用近等基因系方法，还筛选出抗燕麦锈病，大麦茎锈斑病，小麦的腥黑穗病，番茄的线虫、花叶病毒，烟草的黑根瘤等抗性基因以及很多其他的目标基因的分子标记。,2020/5/1,278,178,2.群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记近等基因系的基因作图效率很高，但一个近等基因系的培育耗费时间长。另外，许多植物很难建造其近等基因系，如一些林木植物既无可利用的遗传图谱，又对其系谱了解很少，几乎不可能创造近等基因系。为此，必须配制很多的暂时性和永久性分离群体进行重要农艺性状基因的标记筛选。,2020/5/1,278,179,为了减少遗传图谱构建的工作量，1991年，Michelmore等提出了群体分离分析法（bulkedsegregantanalysis,BSA）（图17-7b），为快速、高效筛选重要农艺性状基因的分子标记打下了基础。BSA分析方法见图17-7c。,2020/5/1,278,180,图17-7NIL和BSA法分析(a)近等基因型的创建(b)F2极端群体的分离(c)近等基因系和群体分组分析两种方法的分子标记分析（1995,Tanksley等）,2020/5/1,278,181,以某一抗病基因为例说明BSA方法的应用原理。用某一作物的抗病品种与感病品种杂交，F2抗病基因发生分离。依抗病性表现将分离群体植株分为2组，1组为抗病的，另1组为感病的。,2020/5/1,278,182,然后分别从两组植株中选出510株抗、感极端类型的植株提取DNA，等量混合构成抗、感DNA池。对这两个混合DNA池进行多态性分析，筛选出有多态性差异的标记。再分析F2所有的分离单株，以验证该标记与目标性状基因的连锁关系以及连锁的紧密程度。,2020/5/1,278,183,利用BSA法，Michelmore等（1991）从100个随机引物中筛选到3个与莴苣Dm5/8基因连锁，且遗传距离在15cM内的分子标记。,2020/5/1,278,184,Giovannoni等通过已知的RFLP遗传图谱，选择不同的RFLP基因型建立DNA混合库，筛选出与西红柿果实成熟及茎蒂脱落基因连锁的RAPD标记。,2020/5/1,278,185,目前，由于BSA方法不仅可用于暂时性和永久性分离群体重要农艺性状基因连锁的分子标记筛选，而且也不需要完整的遗传图谱，因此，得到广泛应用。,2020/5/1,278,186,(三)数量性状基因的定位产量、成熟期、品质，大多数抗病、抗逆等重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点。这类性状的表型差异由多个基因位点（数量性状位点，quantitativetraitlocus,QTL）和环境共同决定，子代常常发生超亲分离。,2020/5/1,278,187,筛选与多基因控制的数量性状基因连锁的分子标记要比筛选主基因控制的质量性状复杂得多。因此，用于QTL分析的群体最好是重组自交系和加倍单倍体等永久性分离群体。,2020/5/1,278,188,永久性群体中各品系的遗传组成相对稳定，可通过种子繁殖代代相传，并可对目标性状或易受环境因素影响的性状进行重复鉴定，以得到更为可靠的结果。,2020/5/1,278,189,从数量性状遗传分析的角度讲，永久性群体中各品系基因纯合，排除了基因间的显性效应，不仅是研究控制数量性状基因的加性、上位性及连锁关系的理想材料，同时也可在多个环境和季节中研究数量性状基因型与环境的互作关系。,2020/5/1,278,190,QTL鉴定及标记验证流程见图17-8。数量性状基因定位成功的关键是QTL分析、定位的方法。,2020/5/1,278,191,图17-8QTL鉴定及标记验证流程图,2020/5/1,278,192,从20世纪60年代初单标记分析方法的提出，迄今，QTL定位方法有