基因工程-重组体转入受体细胞PPT课件

1,.,2,.,第五章重组体导入受体细胞,第一节重组体导入细菌细胞,第二节重组DNA导入真核细胞,3,.,第一节重组体导入细菌细胞,一、感受态大肠杆菌的制备,二、重组DNA导入大肠杆菌,4,.,1.目的,增加受体菌细胞膜的通透性。,一、感受态大肠杆菌的制备,第一节重组体导入细菌细胞,5,.,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,2.菌种,6,.,7,.,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,3.制备原理,8,.,4.制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,Onice5-10min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,Onice30min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,9,.,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),（3）转染（transfection),1.外源DNA导入细菌的几种方法,（2）转导（transduction),10,.,转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。,转化(transformation),11,.,转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用,转导(transduction),12,.,转染(transfection),转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。,13,.,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,转化（transformation),噬菌体的生活史,例,转导（transduction),15,.,每gDNA转化成功的细菌克隆数。,3.转化方法,2.转化率,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,（1）热休克法（heatshock）,转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,16,.,10ng载体DNA,100L感受态菌,Onice混合，静置10分钟,42C1分钟,加入1mLLB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热休克法,17,.,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,Onice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,（2）电转化法,18,.,4.平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,19,.,环形重组质粒质粒自我连接,线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。,环形质粒数,（1）重组质粒,5.影响转化率的因素,20,.,21,.,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,要充分，使细菌细胞膜增加通透性。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（2）感受态细胞（competentcells),22,.,把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,6.体外包装的噬菌体的转导,（1）体外包装（invitropackaging）,23,.,cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。,（2）cI857基因突变的噬菌体,24,.,噬菌体1,外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。,在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。,（3）互补型噬菌体,外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。,噬菌体2,25,.,26,.,(4)体外包装过程,27,.,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。,（5）转导,28,.,29,.,第二节外源基因导入真核细胞,一、导入酵母细胞,二、导入植物细胞,三、导入哺乳动物细胞,30,.,转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。,第二节外源基因导入真核细胞,一、导入酵母细胞,1.菌株选择,如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31,31,.,（1）利用原生质球进行转化,2.酵母的转化方法,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,插入外源基因的酵母载体,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,32,.,酵母,0.1mol/LLiCl处理,插入外源基因的酵母载体,感受态,40%PEG（聚乙二醇）,（2）利用Li+盐进行转化,33,.,叶盘,消毒,切取,土壤农杆菌浸泡,看护培养基,愈伤组织,分化幼苗,二、导入植物细胞,1.叶盘法（leafdisk),34,.,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,1-2kV,3-25F电击,愈伤组织,幼苗,分化,2.电击法（electroporation),35,.,又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles),DNA,1.2m钨弹头,吸附,特制手枪,射击植物,装入,3.基因枪法（genegun）,36,.,基因枪,37,.,（1）原理：,三、导入哺乳动物细胞,1.磷酸钙沉淀法,HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,38,.,不需要载体。,