第三章-基因工程载体.ppt

DNA重组技术的基本工具,基因的剪刀（分子手术刀）限制性核酸内切酶基因的针线（分子缝合针）DNA连接酶基因的运输工具（分子运输车）载体,第三章基因工程载体,第一节克隆载体第二节表达载体第三节其它特殊用途载体,本章重点掌握的内容,掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。克隆载体应具备的条件。质粒的基本性质。标记基因的分类及其作用。原核表达载体的表达元件，有哪几种表达方式。,基因工程流程图,遗传物质+载体重组的DNA分子引入细胞或生物体内复制与表达稳定地遗传给下代,1）独立的一个基因或DNA片段，不能自我复制，一般不可以进入受体细胞的；2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。基因工程载体（vector）：能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗传的DNA或RNA分子。,载体的概念,Recombinantvector,Transformationofbacterialhostcell,Cellpropagation,载体的功能,载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体的要求,A、复制起点：能在受体中复制；B、筛选标记；C、限制性内切酶切割位点；D、外源基因的表达：启动子。E、载体的大小：原则上要求载体越小越好；F、适当的拷贝数；G、载体的安全性：质粒不能随便转移;,载体的分类,按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中按来源分类质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体,第一节克隆载体,质粒载体噬菌体载体噬菌体-质粒杂合载体人工染色体,一、质粒载体,1.质粒的概念质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可自我复制和表达。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。分子量在1-200kb之间。,大肠杆菌的质粒,一、质粒载体,2.质粒的空间构型共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）,一、质粒载体,开环DNA（opencircular，ocDNA）一条链上有一至数个缺口。线形DNA（linear，LDNA）,一、质粒载体,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。,SC,OC,L,3.质粒的基本特性质粒的自主复制性质粒的不相容性质粒的可转移性携带特殊的遗传标记,一、质粒载体,一、质粒载体,a.质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringentplasmid）(拷贝数少，为1-5个)和松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达10-200个拷贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。,一、质粒载体,b.质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,一、质粒载体,c.质粒的可转移性接合型质粒(含tra基因)能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求非接合型质粒(不含tra基因)不能在天然条件下独立地发生接合作用。用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒。,一、质粒载体,部分质粒虽不含tra基因，但含bom位点，当宿主细胞内同时存在含mob基因的辅助质粒时，mob基因的产物可打开非接合质粒的bom位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。,质粒的可转移性,一、质粒载体,d.携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物标记基因的作用1.指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子2.指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞,一、质粒载体,标记基因的种类1.抗性标记基因（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdr2.营养缺陷标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如LEU2，HIS4等。3.生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如LacZ4.报告基因氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、-葡萄糖苷酸酶基因（gus）,一、质粒载体,常用的遗传标记基因-半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ）-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。荧光素酶基因荧光素酶是由萤火虫产生的可催化荧光素氧化的酶，并产生荧光。,一、质粒载体,-互补(-complementation)蓝白斑筛选,一、质粒载体,互补显色反应蓝白斑筛选,一、质粒载体,4.质粒载体的命名,一、质粒载体,5.质粒载体构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Ampr,A、删除不必要的DNA区域:尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。B、减少限制性酶切点:缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别的选择标记：通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。D、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。E、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。,质粒的改造,一、质粒载体,6.常用质粒载体,复制起点,遗传标记基因,克隆位点,克隆位点,在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。,TCr,（1）pBR322,一、质粒载体,含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列，即lacZ基因。在lacZ基因中靠近5端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。,（2）pUC系列质粒载体在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体(转化载体后，阳性克隆在有选择压力的培养基上能正常生长)，其组成如下：,?,?,?,一、质粒载体,（3）穿梭质粒载体(shuttlevector)：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌动物细胞穿梭载体,Yeast复制起点,E.coli复制起点,E.coli选择标记,Yeast选择标记,MCS,一、质粒载体,TA克隆载体PCR产物克隆载体用Taq酶的PCR产物3端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5端突出的T，可与Taq酶的PCR产物间连接，即TA克隆。构建方法：如：pMD18-T，pGEM-T,载体的线性化,载体末端补平,载体末端加T,二、噬菌体载体,噬菌体（Bacteriophage）它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA(线性)，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,二、噬菌体载体,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。能被开发成为基因工程的有用载体的原因：1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。,噬菌体的生活周期溶菌周期：烈性噬菌体（virulentphage)感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2.溶源周期：温和噬菌体（temperatephage)感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中，成为它的一个组成部分。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。,二、噬菌体载体,二、噬菌体载体,1.噬菌体载体：双链DNA温和噬菌体DNA大小约为50kb粘性末端：12bp的互补单链当噬菌体进入寄主细胞内后,其粘性末端能通过碱基互补作用,形成环状DNA分子。粘性末端形成的双链区域称为cos位点,它是包装蛋白的识别位点,噬菌体的包装与DNA特性和其它序列无关,但对包装的DNA大小有要求,包装范围大约在36kb-51kb。,二、噬菌体载体,噬菌体作为构建载体材料的依据：噬菌体是一种温和噬菌体；能承载比较大的外源DNA片段；在噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便于多种DNA酶切片段的克隆。构建噬菌体克隆载体的基本策略：切去部分非必须的区域；抹去多余的限制性内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因；建立体外包装系统。,二、噬菌体载体,噬菌体载体的类型（1）插入型载体：具有单一的酶切位点,可供外源DNA的插入。如：gt10，gt11，ZAP载体。,载体长度37kb,插入位点,体外包装,0-14kb,（3751kb）,插入片段,体外包装,二、噬菌体载体,（2）替换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DNA片段，可被外源DNA片段置换。如：EMBL3，EMBL4,二、噬菌体载体,-DNA作为载体的特点-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量构建基因组文库-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,二、噬菌体载体,2.M13噬菌体载体：是一种含单链DNA（ssDNA）分子的丝状噬菌体。这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。,二、噬菌体载体,M13噬菌体的特点感染E.coli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（replicationformDNA,RF-DNA）。可以像质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。无论是双链的RF-DNA还是单链ssDNA都能转染E.coli细胞。不需繁琐的体外包装，可直接转染宿主。,单纯以噬菌体为基础构建的载体:装载量大，转染效率高,操作较难，DNA不稳定。,单纯以质粒为基础构建的载体:有天然的抗性选择标记，操作容易（易于分离和转化），较稳定,装载量小，转化效率较低；,三、噬菌体-质粒杂合载体,(一)黏粒载体(cosmid)也称柯斯质粒载体、粘粒。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,三、噬菌体-质粒杂合载体,黏粒载体的基本特点具有噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)；具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)；具有较高容量（45kb）的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。,不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑。主要用于构建基因组文库,三、噬菌体-质粒杂合载体,常用黏粒载体结构图,三、噬菌体-质粒杂合载体,(二)噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。常用的噬菌粒载体：pUC118和pUC119，pBluescript噬菌粒载体,三、噬菌体-质粒杂合载体,四、人工染色体及其应用,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,或称为自主复制序列(ARS),四、人工染色体及其应用,人工染色体载体（artificialchromosomevector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb-3000kb的外源DNA片段。,四、人工染色体及其应用,(一)酵母人工染色体酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。,四、人工染色体及其应用,(二)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间。主要适用于构建大片段基因组文库,第二节表达载体,第二节表达载体,克隆载体（cloningvector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体（expressionvector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；,表达载体的类型质粒表达载体病毒表达载体大片段表达载体分类：根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体；根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体；,第二节表达载体,（一）原核表达载体真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件：具有复制起点，载体能够独立复制。应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。,一、质粒表达载体,一、质粒表达载体,IPTG：异丙基硫代-D-半乳糖苷,最佳启动子具备的条件：a.强启动子b.诱导型的（热或化学诱导）,一、质粒表达载体,表达形式单一型表达：单一基因的编码区，表达完整单一蛋白。融合型表达：多个基因的编码区的串联体，表达出融合蛋白(fusionprotein)。融合标签蛋白：有利于蛋白纯化和检测；融合多个目标蛋白：则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。,一、质粒表达载体,表达形式组成型表达：在组成型启动子（如：T7噬菌体启动子）的驱动下即可源源不断的表达外源基因。适合对宿主细胞无毒的蛋白表达。诱导型表达：在诱导型启动子和特定环境信号刺激下，外源基因的表达开放或增强。适合有毒蛋白表达，无毒蛋白表达也可。,一、质粒表达载体,表达融合蛋白的表达载体6His（组氨酸）标签表达载体：pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白。GST(glutahioneS-transferase,谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：pGEX系列，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。,一、质粒表达载体,一、质粒表达载体,(二)酵母表达载体真核表达的首选系统原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异，真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达。,Yeast复制起点,E.coli复制起点,E.coli选择标记,Yeast选择标记,MCS,一、质粒表达载体,(三)Ti质粒表达载体Ti质粒（tumorinducingplasmid)是根癌农杆菌中可引发植物产生瘤状物的质粒，是环状双链DNA。,一、质粒表达载体,(三)Ti质粒表达载体T-DNA区：侵染植物时，从Ti质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成有关的基因毒性区（vir区）：激活T-DNA的转移接合转移区（Con区）：存在与细菌间进行接合有关的基因tra复制起始区（Ori区）：保证Ti质粒进行自我复制,Con区,一、质粒表达载体,(三)Ti质粒表达载体目前己开发出两类转化体系:一元载体系统(整合载体系统)：由一个含目的基因的中间表达载体与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组形成的可穿梭的复合型载体。但这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。双元载体系统：它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒，即:微型质粒(mini一plasmid)和辅助Ti质粒(helperTiplastnid)构成。双元载体系统与一元载体系统相比，构建的操作过程比较简单，无共整合过程，构建的频率较高，外源基因的植物转化效率，更常用。,一、质粒表达载体,(四)动物质粒表达载体由质粒作为基本骨架构建而成，带有原核复制区，选择标记基因，启动子，polyA尾信号序列，动物细胞中的选择基因,二、病毒表达载体,种类：杆状病毒表达载体腺病毒表达载体反转录病毒载体SV40病毒型转化载体慢病毒载体应用：外源蛋白的真核表达基因治疗载体疫苗的研制基因功能的鉴定,二、病毒表达载体,病毒表达系统的特点：高转染效率高蛋白表达水平对转染效率很低的细胞进行高校转染（原代细胞等）稳定，可遗传的表达（逆转录病毒）可控制拷贝数,二、病毒表达载体,腺病毒转染基因的优点：速度快，简单，不需任何特殊设备转染后细胞生存率几乎为100%。有向细胞内转染遗传物质而忽视毒性作用的能力。许多细胞类型均可被转染转染后数小时，基因表达便可被分析,二、病毒表达载体,第三节特殊用途的载体,一、插入或定点整合突变载体,(一)基因定点插入/基因敲除载体通过外源基因与靶细胞基因组DNA的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞的特定位置上，使某一位点上的基因发生定点突变。(二)随机插入突变载体1.T-DNA插入突变载体：利用T-DNA的随机插入特性构建的插入突变载体。2.转座子插入突变载体：利用转座子构建的微生物与植物的插入突变载体。,二、启动子探针型表达载体,特点：具有一个无启动子的易检测的基因。用途：分离未知基因的启动子型启动子探针型载体鉴定已知基因的启动子和比较其强弱型启动子探针型载体,三、RNAi载体,RNAinterference（RNAi）是指将外源双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)导人细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA降解的现象，属于转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)的一种形式。,RNAi-RNAinterference(RNA干扰)siRNA-SmallinterferingRNA(小干扰性RNA)dsRNA-doublestrandRNA(双链RNA)RISC-RNA-inducedsilencingcomplex(RNA诱导沉默复合物)Dicer-RNAaseIIIrelatedenzymes(RNAaseIII家族成员)PTGS-Post-transcriptionalgenesilencing(转录后基因沉默),专业术语,三、RNAi载体,三、RNAi载体,RNAi的基本过程：siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA；RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）形成：与RNAi辅助蛋白结合形成RISC；RISC活化：