呈色反应及等电点测定PPT课件

.,1,蛋白质及氨基酸的呈色反应,1.学习蛋白质的鉴定方法并了解其原理;2.学习氨基酸的鉴定方法并了解其原理.,目的要求,.,2,实验内容,双缩脲反应（尿素和蛋白液）黄色反应（头发，指甲，蛋白液）茚三酮反应（氨基酸，蛋白质）,.,3,原理,双缩脲反应,4个肽键的氨基与铜离子形成络合物,.,4,原理,.,5,实验内容,1.加热尿素生成双缩脲,观察双缩脲反应的颜色变化;2.观察透析蛋白液的双缩脲反应的颜色变化.,双缩脲反应,.,6,尿素(晶体)10%氢氧化钠溶液1%硫酸铜溶液蛋白液（取鸡蛋清，加6-10倍水混匀，过滤）,双缩脲反应,实验试剂,.,7,试管及试管架试管夹酒精灯,实验器材,双缩脲反应,.,8,实验操作,见教材,.,9,注意事项,选用干燥的试管,尿素加热时间不能过长(1分钟以内);避免加入过量CuSO4,否则生成兰色的Cu(OH)2能掩盖紫红色.,双缩脲反应,.,10,黄色反应,酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸,硝酸对苯环发生硝化作用，生成黄色的芳香硝基化合物，使蛋白质发生变性,反应原理,硝基酚（黄色）,邻硝醌酸钠（橙黄色）,.,11,实验试剂与器材,见教材,.,12,实验操作,见教材,.,13,原理,茚三酮反应,.,14,实验内容,1.蛋白质(蛋白液)的茚三酮反应;2.氨基酸的茚三酮反应.,茚三酮反应,.,15,0.5%茚三酮乙醇溶液透析蛋白液0.5%甘氨酸溶液,茚三酮反应,实验试剂,.,16,试管试管架酒精灯电吹风,茚三酮反应,实验器材,.,17,注意事项,在滤纸上观察茚三酮反应时,滤纸应该跟火焰保持一定距离.,茚三酮反应,.,18,思考题,1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果,可对水解作用作出什么结论?2.能否利用茚三酮反应可靠的鉴定蛋白质的存在?,茚三酮反应,.,19,蛋白质含量测定（设计性实验）,2010.4,.,20,蛋白质的浓度测定方法,根据它们的物理性质，如折射率、比重、吸光值来测定，如蛋白质的紫外吸收法；利用蛋白质的化学性质，用化学反应的方法测定，如凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法测定；还可用染色法，如用氨基黑、考马斯亮蓝-G250测定；另外还可用萤光激发、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法测定。上述方法中，紫外吸收法、双缩脲法、Folin酚试剂法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法最为常用，它们操作相对简单，不需要昂贵的设备。以下主要介绍这几种方法。,.,21,双缩脲法测定蛋白质含量,原理：在碱性溶液中蛋白质与铜离予形成紫红色络合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸组成无关，该法测定的蛋白质浓度范围为1-10g/l。,.,22,器材试剂,双缩脲试剂标准蛋白液（牛血清白蛋白）分光光度计离心机,.,23,实验操作,尽量详细，涉及计算的最好提前计算好；提前掌握相关仪器设备的使用,.,24,紫外吸收法测定蛋白质含量,由干蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm处有一个紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在280nm的光吸收值与其浓度成正比，因此可作定量测定，该法测定蛋白质的浓度范围为0l1g/L。,.,25,器材试剂,分光光度计离心机,.,26,实验操作,标准曲线制备,.,27,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量,原理：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质结合后，变为蓝色，可在590nm处比色测定，该法反应快、操作简便，消耗样品最少。缺点：不同蛋白质之间差异大（why?），且标准曲线线性较差。测定蛋白质的浓度范围为0.01-1.0g/l。,.,28,器材试剂,考马斯亮蓝G-250染色液配制,.,29,实验操作,标准曲线制备待测样品测定,.,30,重点难点,测定方法的选择；待测蛋白质的选材（蛋白质的含量；蛋白质种类；干扰因素）；制备蛋白质溶液（尽可能多的含有目标蛋白，澄清，无沉淀）；标准曲线制备（待测蛋白液浓度在标准曲线中间）。,.,31,蛋白质等电点的测定,原理,.,32,测定白明胶的等电点:配置不同PH值的缓冲液,加入白明胶后,再加入脱水剂,观察溶液的浑浊程度,指出等电点,蛋白质等电点的测定,实验内容,.,33,0.1mol/l醋酸钠溶液0.1mol/l醋酸溶液95%乙醇1%白明胶溶液1mol/l醋酸溶液,蛋白质等电点的测定,实验试剂,.,34,试管4支(大)试管架吸量量管(5毫升2支,2毫升3支,1毫升1支),蛋白质等电点的测定,实验器材,.,35,蛋白质等电点的测定,.,36,白明胶应先在水浴锅加热,搅拌并溶解,待完全溶解才能使用;滴加乙醇时应边加边振荡.,蛋白质等电点的测定,注意事项,.,37,什么是蛋白质的等电点?蛋白质在等电点溶液中必然沉淀,请结合蛋白质的胶体性质说明以上结论对吗?,蛋白质等电点的测定,思考题,.,38,氨基酸的甲醛滴定,2011.3,.,39,实验目的,掌握甲醛滴定法测量氨基酸含量的原理和方法,.,40,实验原理,氨基酸是两性电解质，在水溶液中达水解平衡是弱酸，完全解离时pH为1112或更高；一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。,.,42,实验原理,.,43,R-CH-COOHR-CH-COOHNH2甲醛N(CH20H)2(氨基酸)(二羟甲基氨基酸）PK:10-12PK:7酚酞（PH9左右由无色变成粉红色）PK：氨基酸完全解离时的PH值,实验原理,.,44,实验试剂和器材,三、器材1锥形瓶2吸量管（2mL、5mL）3碱式滴定管、滴定台、蝴蝶夹四、试剂101m01L标准甘氨酸溶液201molL标准氢氧化钠溶液3.0.5酚酞指示剂4.中性甲醛溶液,.,45,实验操作,1取3个25mL的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入2mL0.01molL的标准甘氨酸溶液和1-2滴酚酞指示剂,向3号瓶内加入2mL水1-2滴酚酞指示剂;然后向1号瓶中加入4mL甲醛溶液，混匀，再向1号瓶滴加0.01molL标准氢氧化钠溶液至溶液显微红色。向2、3号瓶中各加入4mL甲醛溶液，混匀，再分别向2、3号瓶滴加0.01molL标准氢氧化钠溶液至1号瓶颜色。,.,46,重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。氨基氮的实际测得量：氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）0.14008