第七章 生物可降解塑料

,E,1,生物可降解塑料的生产和应用,DrZhouHongboDepartmentofBiotechnologyCSU,2,第一节塑料废物污染和可降解塑料,二十世纪七十年代以来塑料工业得到迅猛的发展，无论是工业、农业、建筑业，还是人们的日常生活无不与塑料密切相关。化学合成塑料在自然环境中很难分解，亦不会被腐蚀，燃烧处理又会产生有害气体，塑料垃圾对环境造成了巨大的危害。,3,普通塑料对环境污染的特点,成分为合成树脂(1)污染范围广(2)污染物增长量快。全世界每年对塑料的需求量为1亿吨。美国专家估计每10年产量将增加1倍。1995年我国的塑料需求量为600万吨，其中对环境有威胁的地膜为88万吨，包装用品为150-200万吨。美国、日本的塑料垃圾占垃圾总量的7%。,4,普通塑料对环境污染的特点-续,(3)处理难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性，埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如HCl、SOx、CO等。,5,普通塑料对环境污染的特点,(4)回收利用难。塑料制品种类多，填料、颜料多样，难以分拣回收再利用。(5)生态环境危害大。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小，抗病力差。,6,研究和开发生物可降解塑料已迫在眉捷用可生物降解塑料代替部分石油化工合成塑料，禁用某些塑料制品如意大利已立法规定自1991年起所有包装用塑料都必须生物可降解，我国也已开始考虑禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。,生物可降解塑料,7,国内外出现的生物可降解塑料,PCL-聚已内酰胺;PVA-聚乙烯醇;PE-聚乙烯,8,生物可降解塑料的特点,工艺简单生产过程污染轻生物可降解性和生物可相容性可进行高分子材料的结构调整：控制营养、环境条件,9,第二节、PHAs的生物合成与应用,采用微生物发酵法生产的聚-羟基烷酸(简称PHAs)，成为应用环境生物学方面的一个研究的热点聚-羟基丁酸PHB3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物P(3HB-co-3HV)或PHBV,10,PHAs除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，还具有生物可降解性和生物可相容性。,PHAs,香波瓶,原料,降解,11,一、PHAs的结构、物理化学性质和应用,多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。由于PHAs具有低溶解性和高分子量，它在胞内的积累不会引起渗透压的增加，是理想的胞内贮藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可写成：,单体数目,12,R为甲基时，单体为-羟基丁酸(HB)；R为乙基时，单体为-羟基戊酸(HV)；R为丙基时，单体为-羟基已酸(HC)；R为丁基时，单体为-羟基庚酸(HH)；R为戊基时，单体为-羟基辛酸(HO)；R为已基时，单体为-羟基壬酸(HN)；R为庚基时，单体为-羟基癸酸(HD)；R为辛基时，单体为-羟基十一酸(HUD)；R为壬基时，单体为-羟基十二酸(HDD)；,R多为不同链长正烷基，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基,13,聚合物命名,R为甲基时，其聚合物为聚-羟基丁酸(PHB)R为乙基时，其聚合物为聚-羟基戊酸(PHV)在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。,14,每个PHAs颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质和机械性能如韧度、脆性、溶点、玻璃态温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。例如PHBV共聚物中羟基戊酸组分的增加可使熔点从180(PHB均聚物)降至75(PHBV共聚物中HV组分的摩尔分数为3040%)。,PHAs的结构、物理化学性质,HV-羟基戊酸,15,大多数有关细菌PHAs的物化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。PHB是高度结晶的晶体，结晶度的范围在5580%，其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张强度等，而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿性等则是PHB的优点，见表7-2-1。,PHAs的结构、物理化学性质-续,16,17,PHB较脆和发硬，但可通过与适量HV共聚而补偿。随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的劲度降低而韧性增加，且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低，使得较易对其进行热加工处理。单体4HB的聚合物或3HB与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。,PHAs的结构、物理化学性质-续,HV-羟基戊酸,HB-羟基丁酸,18,PHB的工业化应用主要存在两个缺点,PHB较差的熔化稳定性，其分解温度约为200，该温度与其熔点相近(约175)；可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用来解决；在环境条件下贮存数日后，PHB易发脆。PHB的老化问题可通过简单的淬火处理来较大程度地解决。,19,PHAs的应用,shampoobottles,bicyclehelmet,20,二、PHAs的生物合成,合成PHAs的主要微生物合成PHAs的主要基质PHAs的代谢途径与调控,21,能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生物。目前研究的较多的微生物：产碱杆菌属(Alcaligeneseurophus,现在更名为Ralstoniaeutropha)假单胞菌属(Pseudonomas)甲基营养菌(Methylotrophs)固氮菌属(Azotobacter)红螺菌属(Rhodospirilum),（一）合成PHAs的主要微生物,22,活性污泥中微生物产生的PHB,23,表7-4各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较,24,真养产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)为革兰氏阴性的兼性化能自养型细菌积累PHB可达细胞干重的90%以上能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HB-co-3HV)改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去，形成4HB或5HV单体与3HB的共聚物。采用带有真养产碱杆菌PHB合成基因的重组大肠杆菌(E.coli)。,工业化生产PHAs的微生物,25,Ralstoniaeutropha,R.eutropha,26,（二）、合成PHAs的主要基质,(1)、糖质碳源葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等。(2)、甲醇甲醇是最便宜的基质之一，ICI拥有生产甲醇单细胞蛋白的技术经验，曾考虑用甲醇作基质生产PHB。甲醇菌积累PHB含量不高，PHB回收成本大，PHB的分子量较小。,27,28,3、气体H2/CO2/O2,真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用H2/CO2/O2产生PHB，其中H2作为能源，CO2是碳源。以H2作为基质按其价格和产率而言(见表1)在经济上是划算的，且H2又是一种干净的可再生资源。可以同时解决两个严重的环境污染问题：温室效应及废弃的非降解塑料对生态环境的危害。安全性问题：解决混合气体爆鸣的安全问题和气体的循环利用问题。控制基质气相中氧的浓度低于气体爆炸的下限(6.9%)是安全的。,29,4、烷烃及其衍生物,假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、酸等产生中等链长羟基烷酸的共聚物(PHAMCL)，共聚物中单体的组成与基质碳架的长度有关。以辛烷作基质连续培养食油假单胞菌(P.oleovorans)，稳定态细胞浓度11.6g/l，PHA的生产强度为0.58g/Lh，,30,（三）PHAs的代谢途径与调控,PHAs的产生机理微生物在碳源过量而其他营养如氮、磷、镁或氧不足时，积累大量PHAs作为碳源和能源的贮存物，或作为胞内还原性物质还原能力的一种储备。当限制性营养物再次被提供时，PHAs能被胞内酶降解后作为碳源和能源利用。,31,胞中积累的PHAs存在形式,以单个粒子的形态存在，每个细胞含有的颗粒数量的大小随微生物种类而不同，在Ralstoniaeutropha中，每个细胞含有8-10个颗粒，每个颗粒直径大小为0.2-0.5m；以非晶体形式存在。具有高度的折光性，颗粒外面包裹着一层膜，没有生物膜那样的典型双层结构，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。,32,ScanningelectronmicroscopeofPHBgranulesinRalstoniaeutropha,33,补料分批培养45h收获的菌体细胞的电镜照相,34,PHAs的代谢途径,不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不同其合成途径也有差异(图7-2)。真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB；深红红螺菌从糖合成PHB；食油假单孢菌等从链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs；一株产碱杆菌从长链偶碳脂肪酸合成PHB；铜绿假单孢菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的PHAs；真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV。,HA-羟基烷酸,35,A,36,PHAs的生物合成和降解同时存在,的,丁酰CoA,37,基因重组细菌,20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于生物合成PHB，来自于多种细菌的PHA生物合成酶PHA生物合成途径的关键酶，已被在分子水平进行了详细的研究，PHA生物合成酶基因已被克隆成功。3个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基因phbA、phbB和phbC克隆并在大肠杆菌中表达。,38,基因重组细菌,研究发现，在真养产碱杆菌中，PHA合成酶的结构基因排列在称为phbC-A-B的一个操纵子上，分别编码PHA合成酶、-酮基硫酯酶和依赖于NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶(见图7-4)。,39,三、PHAs的发酵生产,PHAs实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本。英国帝国化学公司(ICI)认为影响PHAs生产成本的主要因素有菌种原料操作方式提取方法,40,因而降低PHAs的生产成本主要措施,(1)采用廉价基质(如CO2、H2和O2，甲醇，乙醇，葡萄糖及来自农业废物的有机酸等)和提高产物对基质的产率系数，降低发酵原材料的成本；(2)提高生产强度(如选育高产菌株、采用合适的发酵生产方式等)，以降低操作成本；(3)改进提取、纯化技术(如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化操作等)，以降低提取成本。,41,PHAs的流加发酵,在PHAs的生产中，通常采用分批发酵法和流加发酵法，有时用连续培养法来获得高的生产强度。由于Ralstoniaeutropha只有在某种营养成份氮、磷或氧等缺乏而碳源过量的不平衡生长条件下才能大量积累PHAs，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行控制：第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物利用基质形成大量菌体，而多聚体PHAs的积累量很少；第二阶段为多聚体形成阶段，当培养基中某种营养耗尽时，细胞进入PHAs形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。,42,延长细胞的对数生长期，从而可获得较高的菌体浓度；减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制培养液中氨离子浓度不小于200mg/L，否则会降低共聚体的最终产率。在多聚体形成阶段，限制氮源能刺激细胞积累PHAs，但氮源的完全缺乏会极大地损害微生物细胞的合成活性，所以将在PHAs合成阶段以较低的速率限量流加氮源。,PHAs的流加发酵,43,四、PHAs的提取技术,有机溶剂法次氯酸钠提取法酶法表面活性剂-次氯酸钠法其他方法,44,1.有机溶剂法,对于由真养产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)生产PHB，研究初期通常采用的提取方法是有机溶剂法。包括:氯仿、二氯乙烷、1,1,2三氯乙烷、乙酸酐、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯等。原理：有机溶剂一方面能改变细胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHB溶解到溶剂中，而非PHB的细胞物质(NPCM)不能溶解，从而将PHB与其它物质分离开来。具体操作步骤如图7-5所示。,45,图7-5有机溶剂提取PHB的过程示意图,46,(1)当溶剂中含有超过5%(w/v)的PHB时，溶液变得很粘，要去掉细胞的残余物就变得很困难；(2)提取率难以达到很高；(3)使用大量的有机溶剂；(4)造成严重环境污染，操作不便。因此，用有机溶剂提取PHB通常作为一种实验室方法。,有机溶剂的方法的缺点,47,2次氯酸钠提取法,次氯酸钠能够破胞且对细胞中的非PHB的细胞物质(NPCM)的消化很有效，因而用该方法破胞所得产品的纯度较高、提取速度快，避免了有机溶剂提取过程中繁琐的前、后处理工作。但是PHB分子量只有原来的一半。具体操作过程见图2。,48,图2次氯酸钠提取PHB过程示意图,49,各种提取PHB的方法比较,50,（一）降解机制1胞内降解胞内PHB的代谢是个循环过程。图7-9中第四步到第七步是降解过程。首先(第四步)胞内无定形PHB颗粒在解聚酶作用下降解，形成单体和二聚体的混合物。二聚体随之在二聚体水解酶作用下形成单体。,五、PHAs的生物降解,51,图7-9PHB的代谢过程,52,2胞外降解,聚羟基丁酸(PHB)的胞外降解有两种机制，在无菌条件下通过水解进行。这种机制对于PHB在医疗方面的应用(如作为药物的缓适载体、手术缝线等)特别重要。在自然环境中，是酶降解机制。许多细菌和真菌可分泌外解聚酶，有些甚至可以利用PHB作为唯一碳源生长。,53,（二）PHB在环境中的降解,影响PHB降解速度的因素较多包括环境类型：微生物种群及活力，水份，温度塑料制品性质：厚度，表面组织形态，孔隙度，制品中的第二组分,如填充料、颜料在自然环境中，能降解PHB的微生物包括细菌、放线菌、和霉菌等。J.Mergaertd等在土壤中发现有295种微生物可降解PHB，包括105种革兰氏阴性菌，36种革兰氏阳性菌，68种放线菌和86种霉菌。,54,表7-10,PHB在环境中的降解,55,通常情况下，PHB厌氧降解比有氧降解快真养产碱杆菌在厌氧条件下，主要代谢产物是乙酸和R3羟基丁酸，乙酰CoA转变成乙酸的同时生成ATP。而在有氧情况下，乙酰CoA完全分解成CO2和H2O，产生12个ATP。与PHB相比较，有较长侧链的PHA在环境中降解速度较慢，因为低分子量的有机化合物离子化速度比结构复杂的要快，并且长侧链的重复单元增加了PHA的疏水性，抑制或阻碍了微生物在聚体表面的生长。,PHB在环境中的降解,56,六、PHAs工业化和研究进展,(一)影响PHAs工业化的因素(二)国内外研究PHAs的水平(三)研究进展,57,(一)影响PHAs工业化的因素,PHAs早在20世纪60年代就已引起了人们的广泛关注在过去几十年中，有数家公司一直在探索PHB工业生产的可能性。1962，Baptist在美国申请了有关PHB生产的专利。20世纪80年代初，ICI公司和奥地利生物技术有限公司等将微生物合成PHAs的研究推向试生产阶段。,58,1982年，ICI公司使用真养产碱杆菌突变株为生产菌种，以葡萄糖为惟一碳源，在35m3气升环流反应器及200m3机械搅拌反应罐内试生产PHB成功，并以葡萄糖加丙酸为碳源生产聚-羟基丁酸和聚-羟基戊酸无序共聚物P(H