《蛋白表达纯化》PPT课件

重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化,研究目的：生物学活性纯度数量目的蛋白性质：序列相对分子质量氨基酸组成等电点稳定性亲水性,蛋白质表达系统1.大肠杆菌表达系统2.酵母表达系统3.哺乳动物细胞表达系统,大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高基本不分泌，容易形成包涵体，无糖基化等翻译后修饰真核表达系统可进行分泌表达，有天然立体结构及翻译后修饰表达量较低，培养成本较高，操作较复杂表达系统选择：目的蛋白性质，研究目的,大肠杆菌表达形式可溶性表达：目的蛋白含有二硫键且需要正确的立体结构包涵体表达：无活性要求，温度和诱导剂浓度影响融合表达：小分子蛋白大肠杆菌表达载体融合表达：融合各种tag，GST,CBD,GFP等单纯表达：pJLA系列，用NcoI/NdeI导入AUG的载体NdeI识别序列：5CATATG3IPTG诱导：lac，T5，T7启动子热诱导：lamdaphagePL和PR启动子表达载体选择：研究目的，目的蛋白性质和预计纯化方法,重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化步骤1.目标基因全基因合成步骤2.目标基因亚克隆步骤3.E.coli表达菌株转化及筛选步骤4.目标蛋白表达及纯化,步骤1.目标基因全基因合成：1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。3.合成设计好的基因序列，将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。提取mRNA，逆转录PCR得到cDNA,步骤2.目标基因亚克隆：1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。3.测序验证构建质粒的准确性。,步骤3.E.coli表达菌株转化及筛选：1.扩增并抽提构建好的表达质粒。2.将表达质粒转化到高效的E.coli表达菌株中。3.至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件，SDS-PAGE检测蛋白表达情况，筛选出合适菌株。,步骤4.目标蛋白表达及纯化：1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋白。2.培养重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法纯化表达的重组蛋白。3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性，根据蛋白质性质检测其活性,蛋白质纯化常用预处理技术：1、菌体破碎。超声、冻融、溶菌酶2、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术。3、过滤。澄清过滤、除菌过滤4、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析5、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。6、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。,蛋白质纯化常用层析方法1、凝胶过滤。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量较大的先出峰，分子量小的后出峰。2、离子交换色谱。蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱。对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。3、疏水作用色谱。利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。4、亲和色谱。利用蛋白质、多肽与配基的特异性相互作用而进行分离。5、反相色谱。常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高。,各种色谱的主要影响因素填料性质样品浓度上样体积洗脱流速工作缓冲液的pH值，离子浓度,蛋白质纯化常用衔接技术：1、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。2、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量的超滤膜进行超滤。3、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，SephadexG25、G50常用于蛋白质脱盐。,包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用透析、凝胶过滤色谱等方法进行复性。,举例：His-TaqDNA聚合酶纯化性质：6*His标签，DNA聚合酶活性，pI5，热稳定目的：95%以上纯度，大量制备，无核酸酶，保持聚合酶活