光学显微标本的制作技术.docx

光学显微标本的制作技术【实验目的】了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。【实验原理】采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察清楚的，多数动、植物材料都必须经过某种处理，将组织分离成单个细胞或薄片，光线才能通过细胞。为了适应这个需要，就产生了光学显微镜制片技术。光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法，另一类是切片法。非切片法，是用物理或化学的方法，使细胞彼此分离，如有分离法、涂布法、压碎法等。非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。它可以与切片法配合使用，各取其长处。切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片（二）材料：洋葱根或小鼠肝（三）试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，18切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。石蜡作为包埋剂，有其独特的优点，例如：石蜡能切出极薄的蜡片（210m）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。然而石蜡切片的制作过程较长，步骤很多，一步不慎往往导致前功尽弃，而且这些处理引起组织块或多或少地收缩，切片时受湿度影响比较大，这些不足之处必须在制片过程中认真对待，尽量减小它的不良影响。石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。1取材材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。（2）取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。（3）切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。（4）切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过55mm2。2固定组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快。，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g重铬酸钾2.5g硫酸钠1.0g5ml冰醋酸100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。 19固定时，须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的1015倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。（5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。3脱水生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从30乙醇开始，经过50、70、80、95、100至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。4透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。 20甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿适于大块组织的透明。5透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在5060之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为5256，植物材料的用5458的；切片薄的用5860的，切片厚的则用5254的；室温1019时选用5254的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点4648的石蜡，夏季可选5658的。石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，3035放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理23次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需1530min。透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明），将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。6切片（1）石蜡块的固着与整修在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽23mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。（2）切片机和切片刀切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。（3）切片方法切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。（4）切片中存在的问题及补救方法石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功，有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣，甚至完全失败。现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救办法列于表1-3。表1-3 石蜡切片可能产生的问题和解决方法缺 点：石蜡带弯曲不直原 因：1石蜡块上下两边不平行2石蜡块的上下两边不和刀口平行3刀口锋利不一，局部产生差异4蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致5材料未居蜡块正中央6材料大而形不正补 救 办 法 ：1取下台木，将两边修干2调节标本台，使两者平行3移动刀片，改用新的刀口4待蜡块冷却后再切，或重新包埋5用刀片切去部分石蜡，使材料居中6在大的一边切去少许石蜡缺 点：切片分离、不能连成带状原 因：1室温过低2石蜡过硬3材料边缘留蜡太少4刀的角度不适合补 救 办 法 ：1在切片机上方开一电灯或提高室温2在蜡块面加一层45的软蜡或用手指蜡摩擦块面3重新包埋4矫正刀的角度缺 点：切片卷起呈圆筒状原 因：1室温过低2石蜡过硬3刀口太钝4刀的倾角太大补 救 办 法 ：1提高室温2加软蜡3用毛笔将蜡片摊开压住，切23 片即成带4减小倾角缺 点：切片粘附于切片刀，皱摺在一起原 因：1室温过高2石蜡过软3刀口上留有一层石蜡4刀口钝补 救 办 法 ：1降低室温2将蜡块投入凉水中稍浸耒增加3切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡4磨刀或移动刀口缺 点：切片纵裂原 因：1刀有缺口2石蜡块中含有颗粒、杂质3刀口留有碎屑或细丝4组织太硬补 救 办 法 ：1可移动刀口2将颗粒拽去3清洁刀口4让包埋块在水中浸泡缺 点：切片有横纹原 因：1刀和台木的固定螺丝太松2刀口倾斜度太大3刀口有石蜡屑补 救 办 法 ：1旋紧螺旋2可放平12。后再切3用氯仿拭去缺 点：切片厚薄不匀原 因：1切片机有毛病2夹刀不当3，未旋紧标本台螺旋4。石蜡块过硬补 救 办 法 ：1矫正切片机装置2对症治疗3旋紧螺旋4将石蜡块在水中浸泡缺 点：每张切片厚薄不匀原 因：1刀口震动，是由于材料过硬2刀的倾角太大补 救 办 法 ：1。在蜡块表面涂一层火棉胶2减小倾角缺 点：材料发生裂隙破碎或脱落原 因：1脱水不干净2有透明剂残留3石蜡透入时，温度过高或时间过长4由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆5材料太硬或太粗补 救 办 法 ：1无法弥补2增加浸蜡时间，重新包埋3无法补救4用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明5在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液缺 点：切片时发生沙沙声原 因：1组织块过硬2包埋温度过高3，材料内留有结晶体补 救 办 法 ：1浸泡水中软化2无法补救3无法补救缺 点：石蜡块将蜡带抬起原 因：1由于摩擦而产生静电荷所致2石蜡块上面附有石蜡碎屑3刀口上附有石蜡碎屑补 救 办 法 ：1提高室温2用刀片将碎屑清除3用二甲苯或氧仿清除7贴片切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。贴片一般有捞片法和烫板法。捞片法比较简单，首先将切片分割开，投入到48的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中，去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到一年。）或5明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。要注意，不管是使用捞片法还是烫板法，所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面）；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。8染色组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构。染色方法很多，但是染色剂往往是水溶液，因此切片必须经过脱蜡而再度复水。这方法即为脱水、透明的逆过程。由于切片十分菲薄，处理的时间大大减少，一般每级停留约25min。染色是一个复杂的过程，兼有物理和化学作用，对其中的机制目前了解得不很清楚。研究细胞器和细胞内的重要组分都有很多现成的方法，例如显示DNA的Feulgen反应，显示RNA的Brachet反应，显示多糖的PAS反应，显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙钴法等，可以根据不同的要求来选用。9透明染色后的切片须再次经过脱水、透明。标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。10封藏封藏的目的是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。石蜡切片基本步骤之一 器材和试剂一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、 用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、 将器皿在自来水下冲洗干净3、 将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过13次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内1224小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗13次 烘干备用。（二）配制： 硫酸洗液的配制（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。二、准备工作（二）常用液体的配制（一）缓冲溶液：1磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7PH7.0）2枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8PH6.2）（二）固定剂：1甲醛：10%甲醛福尔马林 100ml蒸馏水 900ml注：实际甲醛含量只有3.64.0%但习惯上都将其视为10%。210中性福尔马林钙固定液甲醛液 10ml蒸馏水 90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀12cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。34%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛 8g蒸馏水 100ml加温至60左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。1N NaOHlN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量氧化钠(NaOH )；分子量40005，当量价11N Na0H的配制方法为：m40005140005g。取40005gNaOH溶解于1L蒸馏水中4%多聚甲醛8%多聚甲醛 50ml0.1M磷酸盐缓冲液 50mlPH7.2先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.24Bouin液：苦味酸饱和水溶液 75ml3640福尔马林液 25ml冰醋酸 5m15改良Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 45ml95%酒精 45ml3640福尔马林液 5ml冰醋酸 5m16Carnoy液：冰醋酸 10 m1氯仿 30 m1无水乙醇 60 m1以上三者临用前混合，预冷至4后使用。24小时后固定液失效。（三）染色液1Harris苏木精液A液：苏木精 1g无水酒精 10mlB液：铵矾或钾矾 20g蒸馏水 200ml氧化汞 0.5ml冰醋酸 8ml将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期12个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。2Mayer苏木精掖苏木精 1g钾矾或铵矾 50g碘酸钠 0.2g蒸馏水 1000ml水合氯醛 50g枸橼酸 1g将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。核染色鲜明，染色时间510分钟。用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。3Hasnsen甲矾苏木精的配制A液：苏木精 1g无水乙醇 10mlB液：钾矾 20g蒸馏水 200mlC液：高锰酸钾 1g蒸馏水 16ml三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。4伊红0.51%水溶液或酒精溶液。1水溶性伊红伊红 510g蒸馏水 1000ml冰醋酸 10滴先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。2醇溶性伊红伊红 510g70%90%酒精 1000ml冰醋酸 10滴（四）其它1麻醉剂：24%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。2各级浓度酒精的配制75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）3盐酸洒精多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70酒精内加0.51ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。4碘酒取碘5g，溶于95酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成5生理盐水以氯化纳0.850.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物石蜡切片基本步骤之二 取材 固定三、取材，固定（一） 实验动物的抓取及固定1小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。2实验家兔的抓取及固定方法要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。3豚鼠的抓取及固定方法要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。（二） 实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法1编号和标记方法（1）染色法标记溶液：3%5%苦味酸 黄色2%硝酸银 咖啡色（涂后光照10分钟）0.5%中性红或品红 红色龙胆紫 紫色编号原则：先左后右，从前到后左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。（2）挂牌法（3）耳孔法一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。2实验动物的随机分组方法动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。3实验动物被毛去除方法剪毛法拔毛法剃毛法脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经23min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。脱毛剂配方：（1）硫化钠3g肥皂粉1g淀粉7 g加水适量调成糊状（2）硫化钠8g溶于100ml水中（3）硫化钠8g淀粉7 g糖4 g甘油5 g硼砂1 g加水75ml（三） 实验动物处死处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。热爱生命，珍爱动物。1空气栓塞致死法要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。2麻醉后处死法注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。（1）吸入麻醉法要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约12分钟；（4）注意防火（2）注射麻醉法要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。3脑、脊破坏法要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。4断头处死法要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。5断椎法要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。（四） 实验动物解剖解剖步骤1实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；2从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；3打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；4打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。（五） 取材取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。取材方法和注意事项（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）（3）取材的先后顺序原则。根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm1.0cm0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下12cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。（8）取材要尽量注意脏器的完整性。（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。（六） 固定1固定的目的（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。2固定的对象和方法（1）固定的主要对象是蛋白质；（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：20）。对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。局部灌注固定：肺：肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。注射固定后可将整个肺投入固定液中612小时，再分别切成小块。肝、肾：经肝动脉或肾动脉注入固定液。脑：动物麻醉后暴露颈动脉，以注射针尖向着关部的方向注入固定液。全身灌注固定：步骤：取大白鼠，1%戊巴比妥钠麻醉，打开胸、腹腔，纵向切开心包，用纱线在主动脉弓起始部，然后用50ml注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，将纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血，取用与动物等量的生理盐水注入血管中洗涤，待洗涤处的液体不见血时，再注入固定液。待动物体有一定硬度时即可取材，将所需组织从动物身上切去后，经适当处理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）3固定液的性质和条件（1）能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有较大变化。（2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。（3）使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。（4）尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩。（5）使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲合力。4固定时应注意的事项（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；（2）固定液的用量一般为组织体积的1020倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入，必要的时候可以在瓶底垫上一层棉花；（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；（4）防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形；（5）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；（6）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液（7）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。5固定剂单纯固定剂（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗624小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。（3）饱和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白质，渗透力弱，对组织收缩大，故一般不能单独使用。（4）冰醋酸：渗透力强，沉淀核蛋白，对染色质固定好，使组织膨胀，故一般不单独使用。（5）锇酸：价格昂贵，为强氧化剂，易还原成氢氧化锇，呈黑色沉淀；必须避光保存。不能沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化，所以对蛋白质固定不均匀，锇酸固定的细胞能保持生活时的形态，不收缩细胞，对胞质固定较长好，核的固定不好，锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，经它固定的脂肪和类脂质呈黑色，特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。混合固定剂（1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。一般固定1224小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色，在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液，可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色，对一般染色体并无影响。（2）Zenker液（PH2.3）：此液多用于一般组织的固定，它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长，一般要1236小时，加热可以缩短固定时间。固定后的组织必须流水冲洗12小时，由于固定中含有升汞，在经70%酒精脱水时，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脱汞。（3）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。（4）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为418小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。（七） 组织块修整固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变，或者由于组织在还未固定时就取材，组织器官较软，取材不容易切平。经固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只是将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位。修整组织块时，手术切片一定要锋利。石蜡切片基本步骤之三 水洗，脱水，透明，浸蜡包埋四、水洗1目的：洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。2原则和方法：固定后的组织块的冲洗，一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗210小时。（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。（3）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。（4）用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。（5）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。（6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内五、脱水包埋（一）脱水1脱水的目的组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。2脱水剂（1）乙醇：可作固定剂，又可脱水剂，但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。（2）丙酮：脱水能力比酒精强，但对组织的收缩更大，在组织学制片中较少使用，多用于病理快速切片，或用于某些组化水解酶的固定。（3）正丁醇：是较好的脱水兼透明剂，可与酒精及石蜡混合，用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，进行石蜡包埋时，可先用正丁醇和石蜡等量混合液，然后浸入纯石蜡包埋，正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脱水剂，但由于价格较贵，不常使用。3步骤（1）乙醇脱水过程50%乙醇 68小时75%乙醇 68小时85%乙醇 35小时95%乙醇 12小时95%乙醇 12小时100%乙醇 1小时100%乙醇 1小时（2）丙酮脱水如果是丙酮固定的组织，则不必再经过乙醇，可以用新丙酮更换一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织，均按上述乙醇脱水方法脱水，亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水24小时再入二甲苯透明，透明后浸蜡包埋。（3）正丁醇脱水组织用正丁醇脱水前，先经50%乙醇脱水，然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。50%乙醇 612小时50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水 58小时50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水 46小时45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水 35小时25%乙醇+75%正丁醇 23小时25%乙醇+75%正丁醇 12小时15%乙醇+85%正丁醇 12小时5%乙醇+95%正丁醇 12小时100%正丁醇 1小时100%正丁醇 1小时4注意事项：（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。（2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。（4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%80%的酒精中。（5）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件（二）透明1透明的目的置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用；使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。2透明剂（1）二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对粘膜有刺激作用。（2）苯：性质与二甲苯相似，对组织收缩也较小，组织也不易变脆，但透明较慢，组织在其内可以滞留1224小时，但毒性较大。（3）香柏油：用为透明剂，效果很好，有高度透明作用，能与醇和二甲苯混合，香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小，但透明的速度较慢，3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合，即香柏油不易被石蜡取代，因此经香柏油透明以后，可经过二甲苯短时间媒浸，再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。3二甲苯的步骤：两次透明第一次透明约40分钟第二次时间不一定，要视透明效果而定4注意事项（1）时间不宜过长，否则组织会变脆；（2）组织块脱水必彻底。（三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法）1浸蜡（1）浸蜡的目的置换组织中的透明剂，为包埋做准备。（2）浸蜡的步骤在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯，分别编号1（5254）、2（5254，或5456）、3（5658），其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。（3）注意事项温箱中的温度必须严格控制在60的范围，不能超过60；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。2包埋（1）步骤准备包埋蜡：一般应用硬蜡（5658或6062）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆开纸盒，取出蜡块。（2）注意事项包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成