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过氧化氢酶的制备与测定生化实验报告 正式报告 过氧化氢酶的制备与测定 姓 名：陈鑫培 刘丹丹 董浩 董敏（共同努力成果，排名不分前后。）组 别： 2010级临床三大班11小班 第1组指导老师： 刘 昆 实验日期： 2011年10月20日报告日期： 2011年12月22日目录一、 摘要二、 实验背景三、 实验设计四、 实验目的五、 实验原理六、 实验步骤七、 实验器材八、 实验结果九、 注意事项十、 实验讨论十一、 实验总结一、摘要 过氧化氢酶是催化过氧化氢分解为氧气和水的酶，该酶存在于动物的各个组织内，特备在肝脏中以高浓度存在。H2O2与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH，为了避免这种损坏，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性小的物质，即过氧化氢酶将过氧化氢分解为水和氧气。其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶的溶解性和大分子特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化的过氧化氢酶，并对植被的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等的测定。1、 匀浆：均匀化的物质;尤指分得很细(如用研磨器)并经过充分混匀的生物组织。本实验就是将小鼠肝脏制成匀浆液以进行试验。2、 盐析：一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。本试验即利用硫酸钠破坏过氧化氢酶表面的电荷和水化膜，使过氧化氢酶析出。3、 透析：通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。本实验利用透析袋将过氧化氢酶和小分子杂质分离。4、 层析：“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。本实验即用层析法达到浓缩的目的。5、 Lorry法：原理是以蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色络合物，其颜色深浅以蛋白质含量成正比，进而测定吸光度就可推算出蛋白质的含量。6、 过氧化氢酶米氏常数的原理是米氏方程：表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速度方程：v=VmaxS/(Km+S)7、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质，在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。二、实验背景过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。三、实验设计四、实验目的1、熟练掌握小鼠动物实验的操作方法2、学活过氧化氢酶提取纯化的基本方法3、掌握匀浆、层析、透析的基本原理及操作步骤4、掌握离心机、分光光度计、电泳装置等仪器的使用方法五、实验原理离心：离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。根据离心原理，可设计多种离心方法，常见下列三大类型：差速离心法、密度梯度离心法、沉降平衡离心法。匀浆：分离纯化某一种蛋白质时首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大，通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L,PH 4.0 醋酸-乙醇缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中 ，分离出上清液即获得过氧化氢酶的组提液。盐析：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围的亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大与蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚聚而沉淀。透析：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。凝胶层析原理：凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。福林-酚法：在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物。此络合物将试剂磷钼酸-磷钨酸（Folln试剂）还原，混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅和蛋白质含量成正比。酶米氏常数测定：H2O2被过氧化氢酶分解出氧气和水，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 H2O2 2 H2O + O2 2 KMNO4+5 H2O+3 H2SO4 2 MnSO4+5 O2+8H2O本实验以匀浆层析液提供过氧化氢酶，以1/v -1/S作图求KmSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS，SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。是分析蛋白质和多肽、测定其分子量等常用的方法。六、实验步骤：匀浆盐析透析层析酶浓度测定米氏常数测定酶分子量测定匀 浆1、颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏（按6g计算，不称重）2、加入肝重8.5倍体积（51ml）的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5乙醇，），用组织捣碎机匀浆1-3min（三组合并一块匀浆，快慢交替使用）。【留样】不离心，取200ul匀浆液留样，放-20oC保存。3、冰浴下缓慢滴加肝重0.5倍体积（3ml）的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆30s-1min； 4.匀浆液离心，4，7500rpm，30min后，弃沉淀，收获上清液约44ml于100ml锥形瓶中。5.取匀浆后上清液120uL，加入40 uL 4电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20冰箱保存。【留样】另取200 uL匀浆后上清液-20冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。盐 析1.冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h（用玻璃棒手动搅拌）2.将盐析溶液离心（40C，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀3.用肝重4倍体积（24ml）的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min ，离心（40C 5000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液4.【留样】取盐析后上清样品120ul，用40 uL 4电泳上样Buffer制样，煮3-5min，备用于SDS-PAGE检测，-20冰箱保存。透 析1.将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用（不要捞出来）2.将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内（注意封口要结实），置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液，上清液的10倍体积）中透析两周，中途更换一次透析液（让学生自带水溶VC瓶）3.两周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（40C，7500rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀4.用2mL3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶）， 离心（40C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。5.将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于75%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至11.2ml收样，放置-20冰箱保存。层 析1.凝胶的处理：每组取2.5g sephadexG-200葡聚糖凝胶干粉（膨胀体积3040mL/每克干胶），浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.8) 继续浸泡一天 （准备室操作）。2.装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫，越薄越好。将层析柱垂直夹于铁架上，层析柱下端的止水夹夹紧，向柱中加入约 5-7cm 高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60ml）时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液。3.平衡：打开层析柱出口，控制流速为0.30.5mL/min (约5-10滴/min，不要超速)，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。4.加样：打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液1-1.2ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。5.洗脱：洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)，保持0.30.5mL/min（约5-10滴/min）的流速。洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。6.收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，每管收集1mL（约20滴）。收集管依次在407nm和280nm波长下，以空气调零，测定各管吸光度值。以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。7.收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280 nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物（此次测定以缓冲液调零）。8.【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置-20冰箱保存。9.【留样】取层析纯化样品60uL（浓不浓缩视情况而定），用20 uL 4电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5min，备用于SDS-PAGE检测，放置-20冰箱保存。酶 浓 度1.制作标准曲线表1.不同浓度的标准蛋白组配置123456匀浆:稀释100倍层析:稀释10倍标准蛋白溶液00.20.40.60.81.01.01.0生理盐水1.00.80.60.40.2000试剂AB（9：1）11111111混合液混匀后置于50水浴10分钟，冷却试剂C3.03.03.03.03.03.03.03.0立即混匀，置于50水浴20分钟，冷却后比色（1）标准蛋白的选择：最好选择与待测样品相同或组成类似的蛋白质作为标准蛋白溶液（2）按照表1配成不同浓度的标准蛋白组，编号，以第一管为空白管，在分光光度计上测定650nm的光密度值（3）以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。（4）通过标准曲线分别得出匀浆和层析中过氧化氢酶的浓度（注意匀浆值要乘以100倍，层析值要乘以10倍。）米 氏 常 数 的 测 定1.过氧化氢的浓度再标定：取清洁锥形瓶2只，各加0.04molL的过氧化氢溶液2.0ml和25%硫酸2.0ml。分别用0.002molL KMnO4滴定至微红，记录滴定毫升数，取平均值，计算过氧化氢的浓度。2.反应测速：米氏常数测定：取干燥的50ml锥形瓶5只，编号按下表操作：所加试剂（ml）12345H2O2溶液2.502.001.501.000.50蒸馏水00.501.001.502.001：180稀释的H2O2酶0.500.500.500.500.50酶活的测定：另取两只锥形瓶按下表操作：所加试剂（ml）12H2O22.502.50蒸馏水00H2O2酶（匀浆稀释3000倍）0.5（层析稀释4000倍）0.53.要求试剂加入准确而迅速，立即摇匀，记录室温。蒸馏水的作用是配平各锥形瓶中物质的体积。终止反应：酶加入后立即计时10分钟，到时立即加入25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，终止酶促反应。4.滴定：用标准0.002molL KMnO4的ml数。5. 反应瓶中H2O2浓度计算S=H2O2摩尔浓度加入H2O2的摩尔数3.0=加入H2O2的摩尔数3.0（单位：mmolml）反应速度的计算（10分钟内消耗的过氧化氢 mmol表示）：V=H2O2摩尔浓度加入H2O2的毫升数0.0022.5消耗的KMnO4的ml数=加入H2O2的毫摩尔数剩余的H2O2的毫升数求Km值，以1S为横坐标，1V为纵坐标作图即可求值。酶 分 子 量 测 定1. 凝胶的制备 装板：组装洗净的凝胶玻璃板及胶框。 灌胶：配制凝胶（12%）水3.4ml，30%丙稀酰胺4ml，凝胶缓冲液2.5ml，10%SDS 0.1ml，10%过硫酸铵0.034ml，1%TEMED 0.017ml，共10ml。灌胶：将配制的凝胶液沿着长玻璃板的内面缓缓倒入或用滴定管滴入，小心不要产生气泡。将凝胶加到短玻璃板上沿，然后把梳子插入凝胶顶部。待凝胶凝固后，取出胶框，组装电泳槽，向电泳上下槽内分别加入电极缓冲液。2.加样：将标准蛋白质样品分别加入dorff管中，用4样品缓冲溶液溶解，沸水浴3分钟。分别向样品槽中加入标准蛋白质样品10ul，待测样品5ul。3.电泳：连接电泳仪和电泳槽，打开电源，调节电流。样品进胶前，电流为20mA。样品进胶后，将电流调至40mA。待溴酚蓝迁移至距胶下沿约1.5cm处停止电泳。4.凝胶染色：取出凝胶，放入平皿中，加0.05%考马斯亮蓝染色液，60染色30min。用蒸馏水冲掉凝胶上的染色液后，再放入脱色液中60脱色1小时至可见清晰的蛋白条带。其间换液两次。5.计算蛋白质分子量：计算蛋白质的相对迁移率：以样品槽底部为起点测量各蛋白质以及指示染料溴酚蓝的迁移距离。计算出各蛋白质的相对迁移速率RF值。制作标准曲线。计算待测蛋白质的分子量。七、实验器材1、实验动物： 成年雄性小鼠 （河北医科大学实验动物中心提供）2、主要器材： 托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4冰箱，分光光度计分光光度计的使用：预热仪器。选定波长。固定灵敏度档调节0点调节T=100%测定关机电泳仪的使用方法：首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。离心机的使用方法:设定使用温度 ( 通常为 ) 后，先把转子放入离心舱中，注意转子要卡好轴心；关上舱门，离心舱的温度开始下降，预冷时间要充足。 把样本装入适当的离心管，双双用天平平衡重量，盖上离心管盖子并旋紧。 把平衡好的离心管对称地放入转子中，盖上转子的盖子，注意有无旋紧。 关上离心机舱门，在仪表板上调好所要的转速与时间例如8000rpm,30min 确定所有步骤无误后，按start钮开动，离心机渐渐加速，此时要密切监控。 等到离心达到所要的转速后，确定一切正常才可离去。 完成离心时，要等转子完全静止后，才能打开舱门；请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置，尽速把上清倒出，小心不要把沉淀弄混浊。 在两次离心之间的空档，不需取出转子，但盖上舱门，勿让热空气流入离心舱。 全部使用完毕后，取出转子清理，可以用自来水冲洗，并且倒放晾干。离心舱门要打开，等结冰融化后，再稍加擦拭及清理，若有液体漏出，要用清水洗之。也要回头检查平衡离心管的天平以及桌面，很容易弄脏，要仔细清理干净才离开。八、实验结果层析后蛋白吸光度管号123456789OD4070.0150.0110.0350.0940.1940.2350.2710.2300.147OD2800.0110.0330.0980.2650.5050.4100.3210.2520.162Lorry法测定H2O2酶浓度管号1234567（匀浆）8（层析）浓度00.20.40.60.810.1210.259吸光度00.1330.2590.3830.4700.4950.0740.159分子量测定样品迁移距离2.83.24.24.75.76相对迁移率0.4590.5250.6890.7700.9340.984分子量974006620043000310002010014400log分子量4.994.824.634.494.304.16l 样品溴酚蓝迁移距离6.1cm;l 标准Mark迁移距离3.7cm，溴酚蓝迁移距离6.1cm。l 层析样品迁移距离3.65cm，溴酚蓝迁移距离6.05cm。l 另出现一条迁移距离为3.9cm的条带，分子量大约为196kd，应该是两条60kd左右的条带，有可能是过氧化氢酶断裂成大小不同的亚基造成的。Km值项目12345加入H2O2的ml数2.521.510.5KMnO的用量5.483.72.441.871.59加入H2O2的mmol数*0.03630.090750.07260.054450.03630.01815剩余H2O2的mmol数*0.002*2.50.02740.01850.01220.009350.00795反应速度-0.063350.05410.042250.026950.0102底物浓度s /30.030250.02420.018150.01210.006051/v=1/15.7918.4823.6737.1198.041/s=1/33.0641.3255.0982.64165.29小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化溶液体积（ml）蛋白浓度（mg/ml）酶活Km(mol/L)分子量IU/ml（104）总酶活（103）比活（IU/mg）104回收率%匀浆产物0.21.2135317.0622.921000.0587223KD盐析产物-透析产物-层析产物0.20.2592.1564.3128.3261.06 九、注意事项1) 使用离心机要注意平衡，平稳，对称，牢固，缓慢，以防止损伤离心机。2) 手动玻璃匀浆器助溶时，要注意缓慢旋转推移，时间稍微长一些，使溶解的更充分。3) 每次离心试验后，不要晃动，避免有少量沉淀溶解，对实验结果造成影响。4) 使用分光光度计前，要记得调零。5) 装柱时，避免出现断层，干胶。6) 层析时，加样品和缓冲液时要旋转加入，并及时补充缓冲液，要避免干胶。7) 加样时，要加在加样口里，不要加到样品槽外。8) 拔样品槽模板（梳子）时使用寿命小心，注意不要破坏胶。9) 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命10) 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免玷污。11) 不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透明面12) 每次实验完后，立即洗净比色皿13) 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。14) 再测一系列吸光光度值时,最好保证每一个都在0.70.8之间16）电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。17） 仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。18） 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。19）在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。20）某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必须先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，容易造成不必要的人为机器损坏。21）.离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭，离心结束后取出转头要倒置于实验台上，擦干腔内余水，离心机盖处于打开状态。22）.转头在预冷时转头盖可摆放在离心机的平台上，或摆放在实验台上，千万不可不拧紧浮放在转头上，因为一旦误启动，转头盖就会飞出，造成事故！23）.转头盖在拧紧后一定要用手指触摸转头与转盖之间有无缝隙，如有缝隙要拧开重新拧紧，直至确认无缝隙方可启动离心机。24）.在离心过程中，操作人员不得离开离心机室，一旦发生异常情况操作人员不能关电源(POWER)，要按STOP。25)离心机套管底部要垫棉花或试管垫。26) 通常听声音即可得知离心状况是否正常，也可注意离心机的震动情形。电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。27)防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。(离心管必须对称放入套管中)28)启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。29)分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。30)离心时间一般12分钟，在此期间，实验者不得离开去做别的事。31） 离心管一定要平衡好，放入转子时也要注意位置平衡。绝对不要超过离心机或转子的最高限转速。32）一定要在达到预设转速后，才能离开离心机；若有任何异状，要立刻停机。33）使用硫酸铵等高盐溶液样本后，一定要把转子洗干净，也要清理离心舱。 十、实验讨论1.为什么用肝脏作为材料提取过氧化氢酶？答：因为过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在，尤其雄性小鼠含量更多。实验要减少偶然误差，必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身原因造成的。2.匀浆缓冲液（0.05mol/L,PH=4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）有什么作用？为什么加氯仿？为什么要边加边搅拌？答：PH=4.0环境下，过氧化氢酶不会失活。因为蛋白质在等电点处会有沉淀，因此过氧化氢酶不会沉淀。乙醇可以溶解脂质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。加氯仿是让除去过氧化氢酶以外的蛋白质变性。因为加氯仿能使蛋白质变性，但不会使过氧化氢酶变性。（）滴加时需要边加边搅拌，以防因局部氯仿浓度过高将过氧化氢酶氧化3.盐析时，为什么选择硫酸钠？答：因为硫酸钠可以破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀，而且硫酸钠是中性盐，对PH影响较小。4.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？答：常温下，酶的活性有损伤。搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。5.为什么匀浆透析中用醋酸缓冲液，而盐析喝凝胶层析中用的是磷酸缓冲液？答：醋酸缓冲液的缓冲范围是ph在4.7左右，过氧化氢酶在ph=4.7的溶解度很小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的ph为7.8左右，过氧化氢酶在ph=7.8的溶解度很大。醋酸缓冲液是为了使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解。6为什么透析袋要煮沸后才可以使用？答：因为为了防止干裂，透析袋出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。7为什么在凝胶层析法中要转着加样？答：因为沿着层析柱边缘转着加样，可保持胶面平整，有不平整可用玻璃棒在胶表面轻轻搅拌，使胶粒浮起，沉淀，让胶层重新平整。8.测定OD407和OD280值的目的是什么？答：OD407nm是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值，OD280nm则是普遍蛋白质的紫外吸光峰值。两次比色保证了能准确选择含有过氧化氢酶的收集管。9.电泳前的样本如何处理？答：一般将蛋白质溶解在蛋白质样品溶解液中，在100加热2-5分钟。蛋白质最后浓度一般为0.05-1mg/ml。称取标准蛋白质样品各1mg左右，分别放入带塞的小试管中，按1.0-1.5mg/ml溶液比例，向样品中加入“样品溶解液”。待充分溶解后盖盖，在100的沸水浴中保温3分钟，冷却至室温。制备待测蛋白质样品后可用于电泳。10.有哪些常用的蛋白质染色方法？各自的优缺点是什么？染色方法优点缺点银染色法灵敏度高，常用于蛋白质的纯度鉴定。不适用于蛋白质的定量考马斯亮蓝染色法操作简便用于定量测定，可以固定蛋白质。灵敏度不如银染色法11.LOWRY法测定过氧化氢酶浓度时AB试剂、C试剂使用。