流式细胞术分析技术及应用

流式细胞术分析技术及应用,王万党2015.08.15,中山市小榄人民医院检验科,流式细胞术：Flowcytometry,1930年，Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数,1934年，Moldaven试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞,1949年WallaceCoulter提出在悬液中计数粒子的方法的专利,流式细胞的发展史,1953年，Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器,2-4colorcytometer,10-20colorcytometer,sorterhigh-endres,1953，Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形,1967，发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪,1969，VanDillaFulwyler发明第一台荧光检测细胞计,1975，Kohler和Milstein提出单克隆抗体技术,流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的单个细胞/生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。,流式细胞仪的工作原理,液流系统流动室液流驱动系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统,液流系统：流动室、液流驱动系统,流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。,激光束,荧光信号,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。,激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）,光学系统,流式细胞仪光路图,氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以633nm较强。,前向散射光信号细胞大小,侧向散射光信号细胞内颗粒,散射光信号,外周全血细胞散射光双参数点图,用荧光标记抗体,抗体特异性地结合细胞上对应的抗原,表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强,阳性细胞百分比或浓度,靶蛋白浓度,荧光信号,FL1FITCFL2PEFL3-PC7,荧光的产生,荧光素种类,FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色530nmGFP(绿色荧光蛋白)：绿色PE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nmAPC(别藻兰蛋白）：红色660nm,荧光产生过程,滤光片：OpticalFilters,460500540,460500540,460500540,SP500,LP500,BP500/50,长通短通带通,光收集系统：光电倍增管（PMT）,荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管（PMT）检测。,细胞分选系统,流式细胞仪的细胞分选器通过喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，然后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。,数据分析,Positivecell,NegativeCell,CD4PE,CD4PE,AbsoluteCounts-CellspermL,PositiveCell,AbsoluteCountBeads,NegativeCell,CD4PE,CD4PE,流式细胞仪的临床应用,免疫状态监测淋巴细胞亚群/树突状细胞及其他免疫细胞检测血液病白血病及淋巴瘤免疫分型及微小残留（MRD）检测血小板检测及网织红细胞和网织血小板计数/PNH检测自身免疫病HLA-B27检测感染性疾病CD64检测移植免疫肿瘤细胞因子检测,免疫状态监测,淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血,淋巴细胞亚群,淋巴细胞亚群,淋巴细胞亚群数量检查意义,非特异性的先天免疫细胞,细胞:占外周血T细胞的10以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3量较普通T细胞多NK细胞：占外周血淋巴细胞825，传染病和肿瘤病人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型肝炎的发生和预后可能与NK细胞的表型相关树突状细胞（DC）：分布在淋巴组织和外周血，机体主要的抗原提呈细胞Treg细胞：调节性T细胞，自身免疫性疾病的发生关系密切,血液学中的应用,1）白血病和淋巴瘤的免疫分型2）微小残留（MRD）检测3）CD34+造血干/祖细胞的检测4）活化血小板及网织血小板的检测5）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）6）网织红细胞计数,流式细胞的免疫分型,是白血病分型的重要指标FAB标准，形态学和免疫表型结合适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD),诊断白血病主要标志：B-ALL:CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL:CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML:CD34,CD117,CD33,CD13,cMPOM3:CD34-,HLA-DR-M2:CD19+:t(8,21)M4/M5:CD14+M6:GlyA+,CD71+M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+,M4,M5,M6,M7,T-ALL,B-ALL,M2,M3,微小残留（MRD）检测,白血病微小残留是指患者经过治疗取得完全缓解（CR）后体内残留的微量白血病细胞。白血病微小残留病是白血病复发的主要根源。检测MRD可早期预测白血病复发的可能性、判断疗效、研究白血病发生发展的特征。,2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。,CD41a是特异的血小板表面标记CD61是特异的泛血小板表面标记PAC-1为早期血小板活化指标CD62p为血小板活化的后期指标CD41-CD61复合物检测可提示血小板无力症CD41a-CD42b复合物检测可提示巨大血小板血症,临床意义：1、评估患者血小板活化能力2、检测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成3、辅助诊断血小板活化相关的疾病:血小板无力症、巨大血小板综合症、肝素诱导的血小板减少症、血栓4、鉴别细菌感染和病毒感染性疾病,4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59表达下降，且患者体内的红细胞呈现不均一性，可诊断为PNH。5）网织红细胞计数,A：正常人，B-D均为PNH患者,HLA-B27检测HLA-B27是在有核细胞上表达的I型MHC分子，在淋巴细胞表面尤为丰富强直性脊柱炎，HLA-B27阳性率达90%，其表达与强直性脊椎炎高度相关。,CD64检测CD64主要表达与巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，中性粒细胞表面几乎不表达，当机体患感染性疾病时，中性粒细胞表面CD64表达迅速升高。CD64用于感染性疾病的早期诊断，区分感染和活动性的自身免疫性疾病，监测抗菌药物疗效并预测术后感染，鉴别细菌感染和病毒感染,可溶性蛋白检测CBA（CytometricBeadsArray）,采用的是夹心免疫分析方法，捕捉抗体包被在微球上微球:直径4.4和