生物样品分析中的方法学验证.doc

生物样品分析中的方法学验证张剑萍* ,郭澄# (上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海市200233)中图分类号R927 文献标识码C 文章编号1001- 0408 (2008) 3.- 2469- 03摘要 目的:介绍在色谱分析方法中方法学验证与质控的内容及其有待发展的方向。方法:参阅国际上有关方法学验证的指导原则、国家食品药品监督管理局管理规范,结合本实验室的标准操作规程,对方法学验证与质控的内容及存在的问题进行综合分析。结果:总结了方法学验证和质控的内容,及方法学验证中存在的可能的风险。结论:已建立的方法学验证和质控内容基本完善,但方法学验证的标准也应该根据实际情况制定。关键词生物样品分析;方法学验证;方法学质控生物样品分析方法的建立、验证和应用是临床前药动学和期临床试验研究中的重要组成部分, 关系到药动学研究和生物等效性试验研究的科学性和正确性。其中, 方法学验证(Met hod validation) 是整个试验数据可靠的基本保证,因此其是各个实验室标准操作规程(SOP) 的重点内容。本文根据国际上有关生物分析方法验证的指导原则, 参照我国国家食品药品监督管理局的管理规范, 结合本实验室研究经验, 总结了以色谱分析方法为主的生物样品分析中方法学验证的内容及其标准制定中有待发展的方向,以供同行交流参考。1 意义方法学验证,又称方法学评价、方法学确认等,是整个药动学、生物利用度及生物等效性研究的基础。这是药动学研究有别于其他药理毒理研究的特殊之处。所有药动学研究结果都依赖于生物样品的测定, 只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究并建立检测方法学, 以及得到了标准曲线后, 在检测过程中还应进行方法学质控, 制备随行标准曲线并对质控样品进行测定, 以确保检测方法的可靠性。2 分类及其应用范围按照美国食品与药品管理局( FDA)分类,方法学验证分为全面验证( Full validation) 、部分验证(Partial validation) 和交叉验证(Cross validation) 1 。2.1 全面验证对于一个本质上的新药的分析方法, 以及对首次建立的分析方法需要进行全面的分析方法的验证, 对代谢物进行定量分析的时候也要考虑到进行全面的分析方法的验证。2.2 部分验证已经经过验证的分析方法变更时可考虑做部分分析方法的验证, 部分验证的内容可以根据分析方法变更的程度从只进行日内精密度和准确度的考察到接近全面的分析方法的考察,实际操作中要结合实际情况,以达到客观、严谨的科研目的,确定部分方法学验证的内容。部分方法学验证经常见于如检测方法的改变; 血浆样品采集中抗凝剂的改变; 同一种属的生物基质变化(例如人的血浆改变为人的尿液) ;同一基质的不同种属变化(例如大鼠血浆到犬血浆) ; 相关线性浓度范围的变化; 分析仪器或分析软件工作站的改变; 样品采样量的限制而造成的分析方法过程中的变动(例如儿科中的药动学研究) ;联合用药或特殊的代谢产物影响分析方法的选择性而需要调整色谱条件等情况的分析方法。2.3 交叉验证比较两个分析方法的验证参数。常用于同一物质的不同分析方法的改变, 如从高效液相色谱法到液质联用的变化或两个及两个以上实验室对同一物质按同一方案进行分析时2 。3 内容分析方法中色谱方法比较常用, 在色谱方法中方法学验证有以下内容1 ,3 :3.1 特异性特异性(Selectivity) 要求至少6 个不同个体的空白生物样品无干扰, 并要求提供空白生物样品色谱图、空白生物样品加对照物质色谱图、用药后的生物样品色谱图。如果采用内标方法,还需要提供空白生物样品加内标物质色谱图, 以证明内标中所含杂质不干扰待测药物的分析。3.2 线性3.2.1 线性范围确定。根据生物样品中药物浓度范围, 确定线性范围。建立标准曲线时应随行空白生物样品, 但计算时不包括该点。标准曲线至少有不包括空白在内的6 个点。定量范围应能覆盖全部待测浓度, 不允许将定量范围外的浓度推算为未知样品的浓度。3.2.2 相关系数与反算浓度。通过系列浓度的标准生物样品进行测定, 得到浓度与响应值的回归方程。对于标准曲线的要求除相关系数( r) 值大于0.99 外,还要求经标准曲线反算浓度要在真实浓度的15 %范围内, 标准曲线最高点和最低点在20 %范围内。为保证生物分析数据的质量, 采用何种算法建立标准曲线尤为重要, 分析方法委员会(Analytical met hodscommit tee) 推荐使用加权回归方程检查标准曲线的线性(Linear range) 。与普通最小二乘法不同的是加权最小二乘法(Weighted least squares) 在回归计算时增加了1 个权重因子W , 采用这种方法计算回归直线的斜率和截距, 可使生物样品的测定结果与理论值的相对偏差在不同的浓度区间内比较均衡4 。对于测定浓度范围特别宽的少数情况下, 可采用不同浓度区间2 条回归直线组合的方法。3.2.3 标准曲线各个点的取舍。标准曲线的浓度范围和浓度点一经确定, 在每个分析批次(Batch) 中, 不能为了达到以上对于线性的要求而对标准曲线各个组成点作舍弃处理。只有当标准曲线中某点的反算浓度超过真实浓度的15 % , 才能作舍弃处理, 并要保证舍弃后标准曲线至少包括6 个点。标准曲线最高点和最低点不能作舍弃。3.2.4 最低定量限(LLOQ) 。定量下限是标准曲线的最低浓度点。LLOQ 的确定应该测定至少5 个样品(不包括标准曲线中的最低浓度点) , 保证在真实浓度的80 %120 %内, 变异系数(CV) 不得超过20 % ,并且信噪比应大于5 。LLOQ 区别于检测限(Detection limit ) , 检测限只要求信噪比为3 。3.3 精密度与准确度3.3.1 质控样品浓度确定。一般采用3 个浓度的质控样品,低浓度接近定量下限, 在定量下限的3 倍以内; 高浓度接近标准曲线的上限(一般为高浓度的80 %) ; 中间选择一个浓度, 每一浓度至少5 个样品。目前, 国际杂志上有些论文中质控样品浓度的选择为标准曲线的最低点、最高点和中间浓度。3.3.2 精密度(Precision) 。用质控样品的批内和批间相对标准差( RSD) 表示, RSD 一般应小于15 % ,在LLOQ 及最高定量限(ULOQ) 附近RSD 应小于20 %。一日内每隔2 h 处理一组低、中、高浓度样品,共处理5 组,来计算日内精密度。获得批间(日间) 精密度应至少连续测定3 个分析批次,一般为5 个分析批次,每个浓度至少测定3 个样品。3.3.3 准确度(Accuracy) 。指测定生物样品浓度与真实浓度的接近程度,用REC( %) 表示,一般要求应在85 %115 %内,在LLOQ 及ULOQ 附近REC 应在80 %120 %内。3.4 稳定性根据具体情况, 对分析过程中所涉及到的预处理前、预处理中及预处理后的样品在不同基质、不同放置条件下及不同存放时间进行稳定性(Stabilit y) 验证, 以排除外界因素对测定结果的影响, 保证分析结果的客观性。一般主要考察以下几个方面:3.4.1 贮备液(Stock solution ) 稳定性。验证贮备液在特定溶媒、特定保存温度下(一般2 个温度,室温和冷藏) 、不同放置时间的稳定性, 以确定贮备液的保存条件和保存日期。经过特定贮存条件的贮备液浓度与新配制的贮备液浓度的偏差( % ,Difference) 不超过5 %。偏差= (新配制贮备液峰面积稳定性考察的贮备液峰面积) / 新配制贮备液峰面积100 %。因为所测定的样品是溶媒中而非生物基质中, 故其可接受标准为5 %。3.4.2 待测药物在生物样品中的稳定性。冻融稳定性指制备好的质控样品经过3 个循环的冻融时的稳定性变化情况。质控样品冷冻保存24 h ,放置于室温（自然解融至室温）, 然后再冷冻1224 h , 称为一个冷冻、解融循环。短期放置稳定性指验证样品在生物介质中室温放置412 h 的稳定性, 一般采用室温4 h 。长期冷冻放置稳定性放置时间的设置根据实验中样品采集到样品分析的可能的时间间隔, 一般采用2 、4 、8周。3.4.3 处理好样品(Processed samples) 稳定性。一般指处理好的样品置于自动进样器到进样时间段样品的稳定性。如果自动进样器不能进行温度控制, 一般考察处理好样品放置于室温24 h 的稳定性; 如果自动进样器可控制温度, 则考察设置温度下处理好样品24 h 的稳定性。在该项验证中需要注意的是,如采用内标法, 则内标的稳定性也需要同时进行考察。在稳定性考察中, 每项考察采用低、中、高3 个浓度样品, 每个样品平行操作35 份, 其可接受标准定为每个浓度中67 %的样品与真实浓度的偏差不超过15 %。偏差= (真实浓度稳定性考察样品的测得浓度) / 真实浓度100 %。3.5 稀释超出线性范围的样品可采用稀释(Dilution) 的方法, 但是必须对该项进行验证,采用相同基质进行稀释,最少平行操作6份, 并保证67 %的样品稀释后的测定浓度在真实浓度的85 %115 %内。3.6 基质效应按照美国临床实验室标准化委员会的定义, 基质效应(Matrix effect ) 指样品中除目标分析物以外的其它成分对待测物测定值的影响, 即基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰。在采用质谱方法进行体内药物定量检测时, 应进行基质效应试验,观察基质对药物测定的影响。3.7 残留效应在方法评价中, 线性的最高浓度被测试之后, 必须测试试剂空白样品来评价残留效应(Carryover evaluation) 。其可允许接受的范围为小于LLOQ 的20 %。3.8 保留时间选定一个浓度的样品, 选择不同日期或者不同批次的保留时间(Retention ,采用内标时用两者比值) 测定出其平均值。每个批次中样品的保留时间应在此平均值的85 %115 %内。4 方法学质控生物样本分析方法验证完成之后才能开始测定未知样品。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制, 以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。质量控制内容及相关问题主要涉及以下几个方面:4.1 系统适用性批次的开始应有一系统适用性(System suitability test ,SST) 样品, 一般用相当于标准曲线中间浓度峰面积的无基质样品(溶剂中或流动相中) 来评价柱子理论塔板数、分离度和保留时间等。4.2 质控样品数量及可接受标准方法学应用中的精密度和准确度需要进行监测, 为达到此目的需要设定一定数量的质控样品。质控样品的数量根据每个批次的样品总的数量决定, 一般要求质控样品数大于未知样品总数的5 % , 并遵循4 6 20 原则, 即6 个质控样品中至少有4 个样品的浓度与真实值偏差在20 % 以内,且超出20 %的样品不是同一浓度。根据此原则来决定所分析批次是否被接受。2010年版中国药典规定：质控样品数应大于未知样品总数的5%，不得少于6个。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%；最多允许1/3不在同一浓度的质控样品结果超限。如质控样品测定结果不符合上述要求，该分析批样品测试结果作废。标准曲线的范围不能外延，浓度高于定量上限的样品应采用空白介质稀释后测定；低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，Cmax以前的样品定为零值，以后的样品定为无法定量。4.3 标准曲线的拟订方法学应用中的标准曲线拟合, 权重系数选择和拟合优度要和方法学建立过程中的方法学验证保持一致。4.4 重复分析当色谱分析数据与药动学规律存在矛盾, 色谱行为差、仪器故障、序列问题,或者其他目的的时候,分析样品的批次需要进行重复分析。这种重复分析是允许的, 但是必须记录原始数据和重复分析后的数据,并详细注明重复分析的原因。4.5 分析批次的舍弃处理由于质控样品不符合4 6 20 原则或保留时间不符合要求等原因,批次应作舍弃处理,该组数据不纳入数据分析,但是必须记录舍弃该数据的原因。5 注意问题5.1 方法学验证的内容要根据实际情况制定在实际操作中, 每个试验项目都有其自身的特殊性, 方法学验证的具体内容要根据具体情况制订, 首先要考虑到确保方法的科学性和客观准确性, 其次也要考虑到经济原因、时间因素等。5.2 生物样品分析方法验证中存在的风险5 方法学验证的目的是为了达到客观准确的分析结果, 通过外标已知浓度的样品(Spiked samples) 对生物样品离体后在采集、运输、储藏、处理、进样分析过程中可能遇到的情况进行考察, 以保证在测定未知浓度的生物样品时实验结果的可靠性。但是外标样品, 即在相同的空白生物基质中加入已知浓度的标准品, 与实验动物或受试者给药后的真实的生物样品(Realsamples) 之间可能存在差异, 这些差异主要存在以下几个方面: (1) 稳定性的改变; (2) 回收率的改变,外标样品和真实样品的回收率不同; (3) 不稳定代谢物的存在及其对测定结构的影响; (4) 存在结构类似(色谱行为接