中外奶粉检验标准及方法 PPT课件

1,蛋白质分析在实际中的应用,中外奶粉检验标准及方法,2,有关事件,2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因是奶粉中含有三聚氰胺。,1月26日，针对之前新西兰恒天然的某些奶粉检测出双氰胺残留的情况，国家质检总局已紧急要求新西兰相关部门尽快提供涉毒奶粉的双氰胺含量、批次等详细情况。但相关部门尚未表态是否会对奶粉启动双氰胺检测。,3,有关事件,港府本月初提出立法限制婴幼儿奶粉离境，昨日港府正式在宪报刊登2013年进出口(一般)(修订)规例，建议规定除非获工贸署署长发出许可证，否则禁止从香港输出供36个月以下婴幼儿食用的配方粉，包括奶粉或豆奶粉。规例2月27日交立法会，3月1日生效。,4,现状与结果,1.民众对国内奶粉不信任,5,现状和结果,2.进口奶粉价格飞涨,6,现状与结果,3同品质奶粉价格悬殊,7,解决办法检测,8,解决办法检测,9,解决办法检测,10,解决办法检测,11,解决办法检测,12,解决办法检测,13,1凯氏定氮法,14,2.分光光度法,3.燃烧法,15,三聚氰胺的检测此次新颁布的国家标准中，规定了三种用于对原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定方法，即高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法，以及三种方法的检测定量限（分别为2毫克/千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克）。,16,HPLC凝胶过滤色谱法测定牛奶及其乳制品中的A-乳白蛋白和B-乳球蛋白,牛奶中蛋白含量约为33g/L,其中约80%是酪蛋白,其余20%是乳清蛋白和血清蛋白.A-乳白蛋白(A-lactalbumin,A-La)和B-乳球蛋白(B-lactoglobulin,B-Lg)为牛奶乳清蛋白中2种重要的组分,是2种小型球状蛋白,分别占其总量的40%50%和10%20%.乳清过去曾被认为是一种废品而被处理掉,或是加工成相对低价值的产品,如乳清粉和各种等级的乳清蛋白.事实上,乳清蛋白具有较高的营养价值及功能特性,如调节血压、降低胆固醇、抗病毒、抗癌、抗菌活性、缓解精神压力等.色氨酸是人类必需氨基酸之一,研究显示,用普通配方奶粉喂养的婴儿和用母乳喂养的婴儿相比,两者血浆中的氨基酸水平具有明显差异,前者特别是在色氨酸水平上含量很低.食用A-La和食用酪蛋白相比,食用A-La的大脑中的色氨酸含量高达48%,且减弱了中性氨基酸和色氨酸在穿过血脑屏障时的竞争.这表明,需要在婴儿配方奶粉中加入富含色氨酸的A-La,使其接近甚至高于母乳中A-La的含量.而过高的蛋白水平对婴儿来说也是不健康的,因为乳清蛋白又是一种常见的过敏源,B-乳球蛋白是最主要的过敏源,其次为A-乳白蛋白,因此参照母乳中A-乳白蛋白水平来设计婴儿奶粉配方就显得更为科学化和人性化.为此,对乳制品中A-La和B-Lg的检测成为乳制品质量评判的重要指标之一.反相高效液相色谱法(RP-HPLC)是分析乳清蛋白成分的有效方法之一,与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势,但操作较为繁琐.本文中,笔者采用凝胶高效液相色谱法对A-La和B-Lg的分离条件进行了优化,与现已报道的同类方法相比,样品不需离心,色谱峰尖锐陡直,不但分离度更好,而且降低了成本,缩短了分析时间,20min内可以完成1次测定,为监测目前市场中各类奶源及乳制品的质量提供了有效的方法.,17,1材料与方法1.1材料与试剂奶粉和液态奶由当地超市购得,包括3种婴幼儿奶粉(编号分别为Y1,Y2,Y3)、4种液态乳清饮料(编号分别为UHT1,UHT2,UHTR1,UHTR2),原料奶来自当地奶牛场.A-La(lotL-5385typeI,纯度85%)和BLg(lotL-2506,纯度80%)等牛奶蛋白标准品购自Sigma公司,盐酸胍、B-巯基乙醇购自天津光复精细化工研究所.KH2PO4,Na2HPO4#12H2O,NaH2PO4#2H2O,EDTANa2(2H2O),NaCl和NaN3购自天津市化学试剂一厂;超纯水(Mill-iQ.18.3MVcm);其他为实验室常用试剂.1.2仪器与设备Agilent1100高效液相色谱仪及数据处理平台,美国Agilent公司产品,包括自动进样器、光电二极管阵列检测器(DAD)、柱温箱、进样瓶、涡漩振荡器、针管过滤器、0.45Lm尼龙滤膜;HPLC色谱柱:TSKgelG2000SWxl(7.8mm300mm).,18,1.3方法1.3.1样品预处理1.3.1.1标准样品的处理用去离子水溶解一定量的混合标样B-Lg和A-La,质量浓度分别为2g/L和1g/L.取配好的混合标样溶液400LL加入到1600LL处理液(6mol/L盐酸胍溶液,内含0.1mmol/LEDTANa2,pH=6.0)中,再加入20LL2-巯基乙醇,涡漩振荡器上振荡10s,充分混匀至没有明显泡沫出现.室温孵育90min.上机前用0.45Lm尼龙滤膜过滤.1.3.1.2固体样品和液体样品的处理准确称量5.0g奶粉,用去离子水定容至100mL,溶解充分后取400LL溶液加入到1600LL处理液中,再加入20LL的2-巯基乙醇,接下来的处理过程同标样的处理过程一致.直接取400LL液体样品加入到1600LL处理液中,再加入20LL的2-巯基乙醇,接下来的处理过程同标样的处理过程一致,19,1.3.2HPLC色谱条件HPLC色谱柱:TSKgelG2000SWxl(7.8mm300mm).洗脱液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(NaH2PO4+K2HPO4)+0.1mol/LNaCl+0.005g/LNaN3(pH=7.0),流速为0.5mL/min,进样量为20LL,检测波长为280nm,温度为25e,洗脱时间为20min.1.3.3不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测以奶粉和原料奶作为被检测样品,上样量(按蛋白质量计)均为20Lg左右,乳清饮料样品中蛋白质上样量约为7Lg左右.4%的分离胶,12%的浓缩胶.电泳条件:恒压60V,时间60min,然后恒压120V,时间90min.以光密度计对带色的各谱带进行测定,求得其颜色深度(OD)的积分值,样品谱带OD值和标样谱带OD值作对比计算出样品中蛋白质的含量.,20,2结果与分析2.1HPLC条件的选择优化及与SDS-PAGE分离乳制品蛋白方法的比较A-La及B-Lg的定量检测通常是根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术来完成,作为国家标准(GB/T5413.2-1997),一直以来被广泛应用于蛋白质的分离鉴定,如图1所示.但其具有以下缺点:用时较长;上样量较大,且不同批次的染色剂和脱色剂很难保证每次都有相同的染色结果,因此重现性不好,定量检测差异性较大.尽管RP-HPLC以及超滤技术7-9也常常被用于二者的分离,但前者检测过程中要使用2个相,后者还要进行一些复杂处理过程,所以操作都较繁琐.因此,鉴于当前食品安全环境的严重性,找到一种用时短、准确性高的检测方法显得非常重要.牛奶中几种主要蛋白质的分子量约为1470ku,其中A-La和B-Lg的分子量分别为14.4,18ku.为此,笔者选择TSKgelG2000SWxl作为分离基质.由于B-Lg在接近中性pH时,常以二聚体形式存在,故上机样品和洗脱液需要接近中性,而洗脱速度对目标峰的分离具有重要影响.因此,利用SAS统计软件对洗脱液pH、离子强度和流速3种影响因素进行优化,最终选择了1.3.2所述色谱条件.结果显示,该方法出峰时间短、峰形尖锐对称、分离度好,可以满足A-La和B-Lg的分析要求.,21,图1检测样品(乳清饮料、奶粉、原料奶)及6种蛋白质标样的SDS-PAGE结果,22,2.2HPLC凝胶色谱分离乳制品中的A-La和B-Lg按照上述优化色谱条件,依据保留时间对乳制品中的A-La和B-Lg分离结果见图2和表1.a.混合标样;b.乳清饮料;c.奶粉.图2检测样品及混合标样的色谱结果,A-La和B-Lg均在280nm处有最大吸收值,在248nm处有次吸收值.所以应用峰面积比率(A280nm/A248nm)可以有效地表示出A-La和B-Lg的特征,从而对它们起到很好的分离鉴定.由图2可见,A-La和B-Lg分离度R均达到或接近1,表明所建立的HPLC凝胶色谱法能够对深加工的乳制品中2种清蛋白成分A-La和B-Lg进行成功分离.与李慧等应用C8反相柱对乳清蛋白成分进行分离的结果相比效果更佳,2种乳清蛋白成分(A-La和B-Lg)的分离度更好,且可以对组成成分更复杂的样品进行分离.,23,由表1可知,2种蛋白质的保留时间的重复性非常高(0.5%RSD1.5%),A250nm/A280nm值的重复性也很高(0.7%RSD4.6%).2.3标准曲线的绘制以峰面积(mAU)为y轴,以质量浓度(mg/L)为x轴绘制标准曲线.A-La标样选取的5个浓度:50,100,200,400,800mg/L.B-Lg标样选取5个浓度:200,400,800,1600,3200mg/L.2组分在测定的浓度范围内线性关系良好,结果见表2.,24,2.4方法的稳定性及重现性(n=3)24h后,取出储存的A-乳白蛋白、B-乳球蛋白标准溶液和各种样品,按此方法对样品进行分析.每种各取3份作平行实验.样品中2种蛋白含量的相对标准偏差(RSD)分别为0.6%2.1%,0.7%3%,表明此方法对各种样品中A-乳白蛋白和B-乳球蛋白含量的检测符合要求,方法稳定,重现性良好.2.5回收率取奶粉Y1,Y2,Y3,乳清饮料UHT1和UHT2,每种各取3份,分别加入一定量的标准品混合溶液,制成上机样,回收率的测定结果见表3,可见,回收率均在90%以上,且0.4%RSD3.1%.,25,3结论与国标法规定的电泳法相比,用HPLC凝胶色谱分离检测各种乳制品中的A-La和B-Lg,方法稳定、重复性优越、标准偏差小于5%、回收率高、耗用时间短.应用该方法对乳制品中的A-La和B-Lg在短时间内进行分离和定量检测,无论是对奶源的质量控制还是对加工后成品的质量检测,都可以提供重要的参考标准,修正了传统的凯式定氮法和SDS-PAGE法鉴定乳制品中蛋白的弊端,具有积极的现实意义.,26,2.6样品测定应用凯氏定氮法测定各样