第六章酶人工模拟

1,第六章酶的人工模拟,2,第一节模拟酶的理论基础和策略,一、模拟酶的概念所谓模拟酶就是根据酶的作用原理，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成方法制成的高效、高选择性、结构比天然酶简单、具有催化活性、稳定性较高的非蛋白质分子的一类新型催化剂，也称酶的合成类似物（syntheticenzyme）。或者叫酶模型或者叫人工酶,3,二、模拟酶的理论基础,1.模拟酶的酶学基础酶是如何发生效力的？稳定过度态理论设计模拟酶一方面要基于酶的作用机制，另一方面则基于对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究。催化基团的定向引入对催化效率的提高至关重要。另外，模拟酶与底物的定向结合能力对形成良好的反应特异性和催化效力是非常重要的。,4,2.超分子化学,主-客体化学：主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主-客体”化学。超分子化学：超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用。当受体与络合离子或分子结合成稳定的具有稳定结构和性质的实体，即形成了超分子，兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。,5,一个很好的酶模型应满足天然酶催化的基本准则Stoddort提出六个原则作为衡量标准:(1)底物选择性(2)与底物能迅速结合(3)与产物能迅速分离(4)反应结束后(至少其活性部位)(5)能够再生(6)有较高的转换数其中46是必备条件，而13最好能满足,6,模拟酶的底物选择性可以与原酶有所不同，以适应实际反应的需要对酶功能模拟一般分为三个层次:(1)合成有催化活性的简单络合物。催化效率和专一性都很低，与酶催化机理不同(2)对酶活性中心的模拟。络合物具有一定催化效率和专一性，催化机理开始接近于酶(3)整体模拟包括微环境在内的整个活性部位、作用机理的模拟近年来，酶功能的模拟多集中在第二层次上,7,理想的模拟酶至少有一个主体和一个客体组成。主-客体均可以是有机化合物或其离子。客体常常简单一些，可以是金属离子或金属-配体的配离子主体分子则要精心设计。,8,酶高效催化底物进行转化，是因为酶能和底物结合形成活性中间络合物，变分子间效应为分子内效应，通过邻近效应、定向效应，降低反应系统的负嫡；再通过诱导契合将基态底物转变为过渡态底物，同时通过共价催化、酸碱催化等机制，降低了反应活化能，才得以使底物进行转化。另外，酶的高效、专一，是通过特定的构象将肽链中有关的氨基酸侧链基团组织在一起，形成具有高度选择性，具有降低反应活化能的活性结构，即所谓的活性中心。,9,活性中心:包括决定酶反应专一性的结合基团和直接参与催化的催化基团。因此在构建模拟酶时，一般都要以高分子化合物、高分子聚合物或络合了金属的高分子聚合物为母体，并在适宜的部位引入相应的疏水基，作成一个能容纳底物、适于和底物结合的口袋（pocket）与网兜（basket），同时在适宜的位置引人担负催化功能的催化基团。,10,模拟酶做法:1)利用现有的酶或蛋白质作为母体，在它的基础上再引人相应的催化基团。例：在木瓜蛋白酶的Cvs一25上共价偶联溴酰黄素衍生物，结果形成产物具有很高的氧化还原活性；例：在肌红蛋白的His-上连接钌(II)氨络合物，结果产物具有很强的氧化活性，其催化效率为钌氨咪唑的200倍，比钌氨和去掉了血红素的肌红蛋白组成的络合物高100倍。所以，这些衍生物也可看作是酶的化学修饰产物。,11,第二节模拟酶的分类,根据Kirby分类法模拟酶可分为：1.单纯酶模型-即以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。2.机理酶模型-即通过对酶作用机制诸如识别、结合和过度态稳定化的认识来知道酶模型的设计和合成。3.单纯合成的酶样化合物-即一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。,12,按照模拟酶的属性分类,主客体酶模型：包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉等胶束酶模型：肽酶抗体酶杂化酶进化酶,13,一、主客体酶模型,（一）环糊精酶模型1.水解酶的模拟2.核糖核酸酶的模拟3.转氨酶的模拟4.桥联环糊精仿酶模型（二）合成的主客体模型,14,1.环糊精的结构和性质环糊精（cyclodextrin,CYD）组成：由6-12个葡萄糖分子连接形成环状低聚糖化合物。,分子结构：6个葡萄糖连接-CYD7个葡萄糖连接-CYD8个葡萄糖连接-CYD,15,16,17,1.水解酶的模拟,由于具有疏水空腔和亲水性表面的环糊精（Cyclodextrin,CD）对多种客体分子（包括GPX的底物GSH和氢过氧化物）都有包结作用，因此利用CD作为底物结合部位，通过化学法将多种形式的Se引入CD中作为催化基团，得到一系列CD的衍生物：二位双硒桥联环糊精（2-seleniumbridged-cyclodextrin，2-SeCD）、六位双硒桥联环糊精（6-seleniumbridged-cyclodextrin，6-SeCD）、硒桥联-6-硒代半胱氨酸-环糊精（Selenium-bridged-6,6-amino-selenocystine-6,6-deoxy-(-cyclodextrin，DisecysCD)、6A，6B-二亚硒酸-6A，6B-硒桥联环糊精（6A,6B-diseleniousacid-6A,6B-seleniumbridged(-cyclodextrin，6-diSeCD)。,18,同以往的小分子模拟物相比，这些CD的衍生物都有较高的GPX活力。同时，由于与硒同族的碲不但具有相似的氧化还原特性，而且碲醇更易分解氢过氧化物，因此我们还将双碲键(-Te-Te-)引入-CD中充当催化官能团，成功制备了具有GPX活性的碲化环糊精衍生物：二位双碲桥联环糊精（2-Teleniumbridged-cyclodextrin，2-TeCD）、六位双碲桥联环糊精（6-Teleniumbridged-cyclodextrin，6-TeCD）。它们的活力都高于相应的2-SeCD和6-SeCD，其中2-TeCD是目前已报道的活力最高的小分子GPX模拟物。,19,20,2.核糖核酸酶的模拟,活性中心有两个组氨酸咪唑基及一个质子化赖氨酸氨基Breslow等人设计合成了两种环糊精A、B催化环状磷酸二酯的水解，在碱性条件下水解同时产生和两种产物，而在A的催化下水解只生成，在B的催化下只生成。环糊精底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置对反应的选择性起了决定性的作用。,21,3.转氨酶的模拟,磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是许多转氨酶的辅酶。还需要有特定的结合部位。苯并咪唑基转氨基速度比吡哆胺单独存在时快200倍，而且有良好的选择性。但不具备催化基团。再引入乙二胺使反映速度加速2000倍以上，还为氨基酸的形成创造了极强的手性环境，表现出良好的立体选择性。,22,含核糖的环糊精酶兼具核酸酶、连接酶、磷酸脂酶和磷酸化酶的活力。相临二羟基起关键作用。,23,4.桥联环糊精仿酶模型,桥联CD及桥基上的功能基构成具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。,24,CD识别氨基酸和小肽,25,氧化胡萝卜素的桥联CD酶设计思路,合成的桥联CD对底物胡萝卜素的结合远大于产物视黄醛引入能催化双键的金属卟啉作为活性中心,26,27,细胞色素酶的模拟,四桥联环糊精模拟P450酶模型,28,谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的模拟,利用环糊精的疏水腔作为底物结合位点，硒巯基作为催化基团，制备双硒桥联糊精表现出很高的GPX活力。,29,（二）合成的主客体酶模型,采用冠醚为主体，带有巯基的仿酶模型可在分子内实行“准双分子反应”以合成多肽。具有结合两个氨基酸的能力。,30,具有与伯胺盐的络合能力，分子内的巯基降结合的二肽酯巯解。,31,阴离子受体模拟酶和氢键受体模拟酶,含氮大环聚胺质子化可作为阴离子受体模拟酶的模型。穴状配体【24】冠N6O2利用电性作用力和氢键结合多聚磷酸阴离子。,32,最出色的合成配体,33,34,35,36,二、胶束模拟酶,1.模拟水解酶的胶束酶模型,37,2.辅酶的胶束酶模型3.金属胶束酶模型,38,三、肽酶另外参照酶活性结构合成一些简单的小肽作模拟酶。例：有人合成了一非天然的34肽，它与单链DNA有高亲和性，其二聚体具有核糖核酸酶活力。更多的模拟酶是以合成高分子聚合物为母体的。例：以相对分子量46万的聚乙烯亚胺为母体，再在其骨架氮上引入十二烷基作结合基团，引入咪唑基作催化基团。这个模拟酶和正常的酶一样，能与芳香硫酸酯形成酶-底物络合物，并能催化酯的水解，其速度为游离咪唑基催化速度的1000多倍，比袋鼠肝脏来源的A型芳香硫酸酯酶还要快百倍以上。,39,例：以环糊精为母体，用它的疏水腔作为酶活性中心结合区，在模拟胰凝乳蛋白酶时，可在适当位点上引入羟基、羧基和咪唑基，获得的产物具有与天然酶几乎相同的催化活性，但有更高的pH和温度稳定性。在构建氧化酶的模拟酶时，可采用金属络合物或金属化合物，前者如Fe+与三乙烯四胺的络合物，它具过氧化氢酶的活性水平，结构比血红素简单。例：模拟细胞色素P450设计的酶，在加入咪唑后，催化烷烃羟化和烯烃环氧化，环氧化率达90；如再引入极性“口袋”或“筐柄”结构，使烯烃进行不对称环氧化，具立体专一性，再修饰后可改善其区域选择性和稳定性。,40,Menger等将一系列端基为咪唑基、羧基、羟基或氨基的长链化合物溶于水，形成“簇”，每个簇为一多组分物种混合体系，每一个物种含有一个潜在的催化基团，可与相邻的催化基团协同作用。筛选时发现，它能催化溴化(N,N一二甲基-N-十二烷基)甘氨酸硝基苯酯的快速水解，其中纯的十六烷酸盐形成的胶束最快。更有十六酸盐的胶束还能催化溴化(N,N-二甲基-N-十二烷基)甘氨酰硝基苯胺的水解。这是底物与十六酸盐形成疏水的簇，进而酶样催化快速水解。,41,该胶束还有一定程度的底物专一性，它不降解溴化4-(N,N-二甲基一N-十二烷基)氨基丁酰硝基苯胺。与抗体酶类比，其水解效率更快，反应条件更温和，更方便易得。值得指出的是，它类似于生物进化，从大量易得的体系中筛选最好的，而不是去合成复杂的精心设计的体系，且取得了非凡的效果.,42,肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的肽。Johnsson等为克服苯丙氨酸工业合成的关键步骤草酰乙酸（2-氧丁酸)脱羧反应中所用酶需金属辅酶的不便，想探寻与此不同反应机理的不需金属辅助的脱羧酶，可资借鉴的认识只有:胺可以催化草酰乙酸脱羧，其历程是先形成烯胺，进而脱去CO2。然而尚未发现采用烯胺历程的天然脱羧酶，全新合理设计就成了唯一可行的办法。他们基于胺催化脱羧的六大特性和-螺旋在催化活性中的重要性的认识，以烯胺机理设计出两个多肽。,43,结果发现，其催化效率比丁胺高34个数量级，然而比天然酶低。进而分析认为烯胺形成并不是脱羧酶催化的决速步骤。最杰出的是利用化学和晶体图象数据所提供的主要活性部位(包括结合部位和作用部位)残基的序列位置和分隔距离，将构成酶活性部位位置相邻的残基以适当的空间位置和取向通过肽键连接，而分隔距离则无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节，这样就能模拟酶活性部位残基的空间位置和构象。他们所设计合成的两个29肽-分别模拟了-糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解蛋白的活性分别与其模似的酶相同。,44,在水解2个或2个以上串联的赖氨酸和/或精氨酸残基的C-键时，TrPcpz比胰蛋自酶的活性更强。对于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解，ChPepz比-糜蛋白酶的活性小些，而TrPepz则无活性；对于对甲苯磺酰精氨酸甲酯的水解，TrPopz比胰蛋白酶的活性稍小，而ChPcpz则无催化活性.,45,四、半合成酶,以天然蛋白质或酶为母体用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。如通过选择性修饰氨基酸侧链将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链，即化学诱变法。将辅酶引入结构已明了的蛋白质上是制备半合成酶的又一策略。,46,第三节抗体酶,一、概述抗体酶首先是抗体，具有高度选择性，同时又具有酶提高化学反应速度。所以抗体酶赋予抗体分子和酶两个不同的属性。从研究结果来看，现在越来越具有其理论意义和广泛的应用范围。1抗体酶研究背景1948年LinusPauling提出了酶的过渡态催化理论,被认为酶和底物结合不是在基态上，因为酶与基态底物的结合十分困难，需要克服很大的能障。过渡态结构十分容易与酶结合，因为酶结构经过底物诱导等，亲和力最强。十分容易越过能障，加速催化速度。所以，酶具有催化速度快和高选择性（专一）,47,而抗体的特征是多样性和专一性，被认为一种抗原产生108种不同的抗体，抗体和抗原的专一结合超过了酶的专一性，抗体酶专一性更高。酶的专一性在生物进化上演化了上百万年，抗体的专一性的形成只需要几个星期而已。现在我们可以借助物理和合成化学的发展，利用免疫系统巨大的细胞和分子网络产生催化抗体。,48,在7080年代，W.P.Jencks予言，抗某个反应过渡态的抗体具有催化该反应的能力。1975年前后，抗体酶处于处于探索的开始阶段，一般采用诱导法、引入法进行尝试，一般效率很低，有的还测定不出活性。主要原因是具有催化活性的抗体太少，在大量的抗体中只能有几个，甚至都没有活性。1975年时，G.Kohler2)单体与印迹分子之间的最初作用是非共价的。,83,T6-45,84,T6-46,85,T6-47,86,影响印迹聚合物（MIP）选择性识别的因素,底物结构和互补性聚合物与印迹分子间作用力交联剂的类型和用量聚合条件,87,分子印迹技术在有机合成中被用作催化剂和拆分剂。与以过渡态(TS)类似物法制备抗体酶的原理相同，若用TS类似物作印迹分子，所得聚合物具有相应的催化活性，只是以人工聚合物代替了抗体。使用聚合物作催化剂的活性部位的载体是考虑了酶的大分子特性(如功能基的高度协同性和诱导契合、别构效应、空间张力等动态效应。,88,T6-44,89,（二）分子印迹聚合物的制备方法,其过程包括:1)选定印迹分子和单体，让它们之间发生互补作用2)在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应3)用抽提法等从聚合物中除去印迹分子，聚合物中留有恰似印迹分子的空间。,90,1.预组织法,T6-48,91,2.自组织法,T6-49,92,Robinson和Mosbach从TS(端粒酶)类似物法制备AbE中首次将TS类似物法应用于分子印迹。它们以羧酸酶水解的TS稳定类似物磷酸酯作印迹分子，将含水解功能基的4(5)-乙烯基咪唑和双功能交联剂1,4-二溴丁烷进行模板聚合，然后洗去印迹分子-甲磷酸对硝基苯酯，所得的聚合物催化水解乙酸对硝基苯酯的活性比未用印迹分子的相应聚合物高60%。,93,（三）表面分子印迹,1.无机物为载体的表面印迹2.固体材料的表面修饰，图6-503.蛋白质的表面印迹，图6-514.分子印迹聚合物在对映体分离上的应用图6-525.分子印迹聚合物的优点和局限性,94,T6-50,95,T6-51,96,T6-52,97,（四）生物印迹,生物印迹是指在天然的生物材料上进行分子印迹，从而产生对印迹分子具有特异性识别的空腔的过程。T6-541.以蛋白质为基础的生物印迹2.以糖类为基础的生物印迹酶,98,1.以蛋白质为基础的生物印迹,如果在天然蛋白分子上可以产生GSH结合部位，那么再在结合部位引入催化基团就能够产生具有GSH活力的人工酶。因此，我们以卵清蛋白为原料，以GSH修饰物GSH-2DNP为模板分子，利用生物印迹技术，制造出了对GSH具有特异性结合能力的印迹蛋白质，然后利用二步化学诱变法将催化基团引入印迹蛋白质GSH结合部位，从而产生了具有GPX活力的人工模拟酶。印迹酶为卵清蛋白的一、二聚体，其中二聚体表现出较高的活力，其最高的MP1可达817U/mol。,99,主要过程,首先使蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象。加入印迹分子，使印迹分子与部分变性的蛋白质充分结合。待印迹分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印迹的蛋白质。经透析等方法除去印迹分子,100,Mosbach小组以正丙醇沉淀-胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-D一色氨酸乙酯的复合物，干燥后放在环己烷中反应，可以催化合成N-乙酰一D-色氨酸乙酯。然而，酶被冻结的接受D-型衍生物的构象在水中会变回其天然构象，在水中即失去对D-型氨基酸的专一性。,101,二、分子印迹酶,1.印迹底物及其类似物2.印迹过渡态类似物3.表面印迹过渡态类似物,102,Bystrom等以含有甾体分子的乙烯基单体作印迹分子，将它与二乙烯基苯共聚，洗去未反应的单体，以LiAlH4/THF除去印迹分子，多次处理后得到低膨胀率(120%)和高膨胀率(200%)的模板聚合物，其印迹分子的除去率为50-60%和7080%，分子空腔内带有游离的羟-基。然后以LiAlH4的THF溶液活化，洗去未反应的LiAlH4可分别获得定向甾17-或3-位官能团(氢化物)化的模板聚合物珠。将它们悬浮于THF中，可高区域选择性还原甾体酮(17-或3-位)，其-型轻基产物明显增加。,103,T6-55,104,T6-56,105,2.印迹过渡态类似物,T6-57,106,T6-58,107,T6-59,1