第3章：蛋白质-2013年

第3章蛋白质,Protein,第一节前言,蛋白质Protein第一重要,蛋白质分布广泛、功能多样,1.催化功能-酶（如：淀粉酶）2.结构功能-皮、毛、骨、牙、细胞骨架3.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白4.防御功能-免疫球蛋白5.运输功能-血红蛋白6.信号传递与识别受体蛋白7.调节功能-调节基因表达和细胞周期调控，如转录因子、细胞周期蛋白等8.贮藏功能-种子中的谷蛋白、卵清蛋白等9.激素、糖蛋白、视色素、味觉蛋白、毒素蛋白等,一、蛋白质的生物学意义,没有蛋白质就没有生命。,1、元素的组成：C、H、O、N、S等N的含量一般为16%凯氏定氮法测定蛋白质的含量：蛋白质含量=蛋白氮6.25（6.25=1/16%）2、组成单位氨基酸,二、蛋白质的组成,三聚氰胺cyanuramide分子式C3H6N6蜜胺,牛胰脏RNase蛋白分子氨基酸组成,第二节氨基酸,氨基酸的分类,1、根据来源：内源AA和外源AA,2、根据是否组成蛋白质：,基本氨基酸(蛋白质氨基酸):蛋白质的组成单位，20种;稀有蛋白质氨基酸：非蛋白质氨基酸：,一、蛋白质的组成单位基本氨基酸,1.化学结构R-CH(NH2)-COOH含有氨基的羧酸R代表氨基酸之间相异的部分，叫R基，又称为侧链。,酪氨酸分子,除脯氨酸外，其它均具有如上结构通式。,不变部分,可变部分,2.结构通式,蛋白质的基本结构单位是氨基酸组成蛋白质的基本氨基酸有20种，除脯氨酸为-亚氨基酸外，均为-氨基酸除甘氨酸外，都具有旋光性（+、-）和光学异构体（D或L型）,什么是-氨基酸？-C-C-C-C-COOH-C-C-C-C(NH2)-COOH-氨基酸-C-C-C(NH2)-C-COOH-氨基酸-C-C(NH2)-C-C-COOH-氨基酸,L-构型与D-构型互为镜像,二.基本氨基酸的结构及分类,（一）按侧链R基的极性：1、非极性氨基酸2、极性氨基酸2.1碱性氨基酸2.2酸性氨基酸2.3非解离的极性氨基酸,丙氨酸Alanine(A）缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基丙酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine(V)亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基异戊酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine(L)异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基异己酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine(I)脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基-甲基戊酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline(P)甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,吡咯,-吡咯烷基-羧酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine(M)苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,硫醚,-氨基-甲硫基丁酸,1.非极性氨基酸,苯基,-氨基-苯基丙酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine(F)色氨酸Trytophan,1.非极性氨基酸,吲哚,-氨基-吲哚基丙酸,丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Trytophan(W),难溶于水，具有很强的疏水聚合能力，脯氨酸成“结节”。R基团疏水性强，在蛋白质高级结构中成疏水键，对稳定高级结构很重要。,非极性氨基酸的特点：,精氨酸Argini(R)赖氨酸Lysine组氨酸Histidine,2.1碱性氨基酸,胍基,碱性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带正电荷,-氨基-胍基戊酸,精氨酸Arginine赖氨酸Lysine(K)组氨酸Histidine,2.1碱性氨基酸,碱性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带正电荷,，-二氨基己酸,精氨酸Arginine赖氨酸Lysine组氨酸Histidine(H),2.1碱性氨基酸,咪唑基,组氨酸在pH值7.0时侧链基团带部分正电荷,-氨基-咪唑基丙酸,天冬氨酸Aspartate(D)谷氨酸Glutamate,2.2酸性氨基酸,酸性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带负电荷,-氨基丁二酸,天冬氨酸Aspartate谷氨酸Glutamate(E),2.2酸性氨基酸,酸性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带负电荷,-氨基戊二酸,甘氨酸Glycine(G)丝氨酸Serine苏氨酸Threonine天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine,2.3非解离的极性氨基酸,氨基乙酸,比非极性氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,甘氨酸Glycine丝氨酸Serine(S)苏氨酸Threonine天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine,2.3非解离的极性氨基酸,羟基,-氨基-羟基丙酸,2.3非解离的极性氨基酸,-氨基-羟基丁酸,甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine(T)天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine,甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine天冬酰胺Asparagine(N)谷氨酰胺Glutamine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine,2.3非解离的极性氨基酸,酰胺,甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine(Q)半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine,2.3非解离的极性氨基酸,甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine半胱氨酸Cysteine(C)酪氨酸Tyrosine,2.3非解离的极性氨基酸,巯基,-氨基-巯基丙酸,甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine(Y),2.3非解离的极性氨基酸,-氨基-对羟苯基丙酸,（一）按R基的极性分:非极性氨基酸-Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Met,Pro,Trp.极性氨基酸极性带正电荷的碱性氨基酸-His,Lys,Arg极性带负电荷氨基酸酸性氨基酸-Glu,Asp非解离的极性氨基酸-Gly,Ser,Thr,Tyr,Gln,Asn,Cys.,小结,小结,（二）按R基的化学结构分:脂肪族氨基酸Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Met,Cys,Ser,Thr；Glu,Gln,Asp,Asn,Lys,Arg.芳香族氨基酸Phe,Tyr,Trp杂环氨基酸His。杂环亚氨基酸Pro,（三）从营养学角度分:必需氨基酸：8种。苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸Thr、Ile；Lys、Val、Leu；Trp、Phe、Met.IleMetLysValLeuTrpPheThr一家来写两三本书半必需氨基酸：精氨酸和组氨酸（Arg、His）非必需氨基酸：10种组氨酸是婴儿和少儿的必需氨基酸。,植物能够合成所有的氨基酸，但是各种植物蛋白的氨基酸组成差异较大，因此，某种植物蛋白能完全符合人体和动物的氨基酸比例是没有的。当某种氨基酸含量低于标准水平时，不论其它必需氨基酸比例如何适当，其营养价值必然大减。这种最低量的必需氨基酸称为限制性氨基酸。如禾谷类种子的小麦、大麦、玉米、大米等，赖氨酸为第一限制氨基酸。,限制性氨基酸,三.稀有蛋白质氨基酸,在某些蛋白质中存在的少数不常见氨基酸。由相应的基本氨基酸经化学修饰而来的。,四.非蛋白质氨基酸（不是组成蛋白质的氨基酸）,广泛存在于各种细胞和组织中，以游离状态或结合状态存在，不参与蛋白质的组成，种类已超过250种。大都是氨基酸的衍生物，有些是、或氨基酸，有些是D型氨基酸，例如鸟氨酸、胍氨酸、丙氨酸、D谷氨酸等。目前认为有些非蛋白质氨基酸是某些代谢过程的中间产物或重要代谢物的前体。如：瓜氨酸和鸟氨酸精氨酸5羟基色氨酸杀虫杀菌。茶氨酸品质。多巴胺神经递质绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。,五.氨基酸的理化性质,(1)无色晶体;高熔点;一般有味(2)在水中溶解度差异很大，溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂；,1、一般物理性质,2、两性解离与等电点,氨基酸是两性电解质，在结晶形态或在水溶液中主要以两性离子状态存在。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,氨基酸在水溶液中的离子化程度与pH值有关，pH值低时以阳离子状态存在？，pH值高时以阴离子状态存在？。,阳（正）离子两性离子阴（负）离子pHpI,氨基酸的等电点pI：,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸的氨基和羧基的解离度完全相等，即正离子=负离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，成为两性离子(也称兼性离子)。,氨基酸的等电点pI(Isoelectricpoint）：氨基酸净电荷为零时所处溶液的pH值。,AaAaAa,在pI时,整理得：H+2K1K2,据质量作用定律：,等电点的推导,-H+2=-K1-K2pH=pI=(pK1+pK2)/2,氨基酸的pI是两性离子状态两侧pK值的算术平均值中性氨基酸pI=(pK1+pK2)/2酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COOH)/2碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,氨基酸的等电点的计算,丙氨酸（一氨基一羧基）:pK1=2.34,pK2=9.69pI=(pK1+pK2)/2=6.02,中性氨基酸pI=(pK1+pK2)/2,天冬氨酸（二羧基一氨基）,酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COOH)/2,碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,赖氨酸（一羧基二氨基）,提问：中性氨基酸pI一般为6.0为什么偏酸性？,提问：大多数氨基酸在中性(pH=7)时,带电？,COOH解离程度略大于-NH2的得电子能力,提问：酸性氨基酸的pI(更偏酸、更偏碱）？,更酸（3.0左右）,碱性氨基酸pI更碱（7.610.7),提问：碱性性氨基酸的pI(更偏酸、更偏碱）？,负,提问：某AA溶于pH7的水中，所得溶液的pH为6。问此AA的pI是6、=6还是6？,等电点的应用溶解度最小，易于沉淀，利用这一性质可以分离制备某些氨基酸。Aa的带电性质-电泳/离子交换法分离混合Aa。,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个不对称-碳原子，因此有L-和D-型两种光学异构体。自然界的氨基酸主要以L-型存在。,3.氨基酸的光学性质,3.1旋光性和光学异构体,3.2氨基酸的光吸收,20种Aa在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(20S沉降系数S与分子量没有正比关系。沉降系数相加没有意义：两个亚基单独测定分别为20S、60S，但聚合体测定并不等于80S，20S+60S80S,2.凝胶过滤法（GelFiltration）,凝胶法过滤只适于球状蛋白分子测量,LogM=k1-k2Ve,蛋白质的洗脱体积与其分子量有关：,（Ve为洗脱体积）,测得几种标准蛋白质的Ve；以分子量对数对Ve作标准曲线；测出待测样品的Ve；查标准曲线确定其分子量。,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPolyacryamideGelElectrophoresis，PAGE）,常规PAGE净电荷，分子量，形状。SDSPAGE:迁移率主要取决于分子量，而电荷和分子形状无关。可以估算出不同蛋白质的分子量。,四.蛋白质的沉淀反应,破坏蛋白质的水膜中和蛋白质的电荷,P62-63,高浓度的中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱等试剂可破坏蛋白质胶体稳定条件，而产生沉淀。,蛋白质沉淀。,蛋白质溶液的稳定性：电荷、水膜,加入大量中性盐若在蛋白质溶液中加入少量的中性盐，则蛋白质的溶解度会增加，这种现象叫盐溶。,分子在其pI时，容易互相吸引，聚合沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,蛋白质的沉淀反应,若在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，使蛋白质沉淀析出的现象叫盐析。（用于分离纯化蛋白质）,蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，当盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，形成沉淀。,（NH4）2SO4）,加入有机溶剂,向蛋白质溶液中加入有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮）会使蛋白质沉淀，为什么？,有机溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质周围的水膜；有机溶剂的介电常数比水小，导致溶液的极性减小，增加了蛋白质之间的静电吸引力，从而聚集沉淀。,加入重金属盐pHpI时，加入HgCl2、AgNO3、Pb(Ac)2、FeCl3加入生物碱试剂或某些酸类pHpI时，蛋白质带正电荷，易于生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应等电点沉淀：中和电荷热变性使蛋白质沉淀,总之，破坏了蛋白质胶体的稳定条件之一破坏水膜或中和电荷，就可使蛋白质沉淀析出,温和结构和性质没有发生变化-非变性沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法,可逆沉淀,强烈条件沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化-变性沉淀。加热、强酸碱、重金属盐（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）、生物碱。,不可逆沉淀,五、蛋白质的变性与复性,1、蛋白质的变性：天然蛋白质因受到某些物理和化学因素的影响，使蛋白质分子原有的高级结构受到破坏，从而引起蛋白质理化性质和生物学功能的改变或丧失，但未导致一级结构变化。,天然构象（有活性）无规线团（无活性）,理化因素,P63-64,物理因素加热（70100）、剧烈振荡或搅拌例如：卤水（少量MgCl2）豆腐、煎炒烹炸紫外线、X射线、超声波例如：皮肤粗糙、白内障、杀菌化学因素强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、甲醛、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇例如胃酸、烈酒,2、蛋白质变性的因素有：,生物活性丧失（最主要）:如酶失活理化性质改变溶解度下降，易沉淀结晶能力丧失渗透压力、扩散速度降低粘度、旋光性负值上升，等电点上升生化性质改变肽链松散、反应基团增加、易被蛋白酶水解。,3、变性蛋白的特征：,维持蛋白质高级结构的次级键和二硫键被破坏；蛋白质分子从有序卷曲结构变为无序松散结构；一级结构完好，分子量和分子组成不变。,4、蛋白质变性的本质：,5、变性的预防和利用：临床急救农药中毒消毒：75%乙醇食品制作：豆腐酶制剂的制备,大纤维,皮层细胞,鳞状细胞,微纤维,微纤维,原纤维,螺旋,卷发(烫发)的原理,永久性卷发（烫发）是一项生物化学工程，-角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为-构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。,定义：变性蛋白质去除变性因素后，恢复原来的空间结构和生物活性的现象。本质：一级结构决定高级结构,核糖核酸酶A,6、复性(renaturation),理论上可以，但很难使外界因素完全复原。,提问：是否所有的蛋白质变性都是可逆的？为什么？,六、蛋白质的光学性质紫外吸收特性,大部分蛋白质均含有带芳香环的Phe、Tyr、T