流式微球联合检测炎症性因子.doc

流式微球联合检测炎症性因子IL-6、TNF-和MCP-1方法学的建立和评价令狐颖1 张程2 陈艳2 黄山基金项目：贵阳市科技局社会发展领域科技攻关项目2010筑科农合同字第1-社-35号和贵州省卫生厅立项资助项目Gzwlj2009-1-007。*通讯作者。* 许健1 刘志琴3 （1.贵州省人民医院临床检验中心，贵州贵阳 550002；2.贵阳医学院09级硕士研究生；3.本院心内科）【摘要】 目的 建立流式微球分析技术联合检测人血清中细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的方法并对其进行系统性评价。方法 分别将三种选择好一定浓度的捕获抗体（IL-6、TNF-和MCP-1鼠抗人单克隆抗体）包被在三种已激活的不同荧光强度编码的羧基化聚苯乙烯微球上，用正交试验对试验条件进行优化选择，并应用CLSI的有关规则进行方法学评价。结果 实验选择各种捕获单克隆抗体的加入量为10g，各种生物素标记的羊抗人单克隆抗体的稀释倍数为1:540，第一次反应时间为2h、洗涤二次，PE标记亲和素的稀释倍数为1:1000，第二次反应1h洗涤一次。方法学评价显色： IL-6线性范围是1.133333.33 pg/mL，批内变异系数为1.98%2.31%，批间变异系数为3.52%4.17%，准确度相对偏倚为0.19%0.66%，回收率是95.4101.5%，灵敏度为1.13 pg/mL； TNF-线性范围是1.071111.11 pg/mL，批内变异系数为2.67%2.90%，批间变异系数为4.27%4.91%，准确度相对偏倚为0.85%1.53%，回收率是97.3104.2%，灵敏度为1.07 pg/mL； MCP-1线性范围是7.073333.33 pg/mL，批内变异系数为2.63%2.92%，批间变异系数为3.70%4.23%，准确度相对偏倚为0.15%1.06%，回收率是95.2104.3%，灵敏度为7.07 pg/mL.高浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对三种因子有一定的干扰率，低浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对三种因子干扰较小。分别与ELISA方法比较无显著差异。结论 自建的IL-6、TNF-和MCP-1流式微球联合检测技术，可拓展流式细胞分析技术，值得临床推广使用。【关键词】流式微球分析技术（CBA）； 联合检测；细胞介素-6（IL-6）；肿瘤坏死因子-（TNF-）；单核细胞趋化因子-1（MCP-1）)Development and evaluation of a Cytometric Bead Assay Multiplex Detection Method for the detection of IL-6、TNF-and MCP-1LING-Hu ying1,HUANG Shan1，ZHANG Cheng2, CHEN Yan2, XU Jian1，LIU Zhi-qin3(1. Guizhou Province Center for Clinical Laboratory;2.Guiyang Medical College;3. Guizhou Province Peoples Hospital)【Abstract】 Objective To development and Systematic review of a cytometric bead array Multiplex Detection Method for the detection of IL-6, TNF- and MCP-1. Method A certain concentration of three kinds of capture antibody (mouse anti-human IL-6 monoclonal antibody, mouse anti-human TNF- monoclonal antibody, mouse anti-human MCP-1 monoclonal antibody) were respectively coated with three kinds of activated beads, and according orthogonal experiment to select the best test conditions, and applying the relevant rules of CLSI to methodology evaluation. Result In the reaction, the best quantity of the three kinds of mouse anti-human monoclonal antibody was 10g, the best dilution of biotin-labeled monoclonal antibody was 1:540, the best incubation time was 2 hours, the first washing time was 2, the beat dilution of streptavidin-PE was 1:1000, the best incubation time of streptavidin-PE was 1 hours, the second washing time was 1. According the methodology evaluation, the linear range of IL-6 was 1.13-3333.33 pg / ml, the intra-assay of variation was 1.98% and 2.31%, the inter-assay of variation was 3.52% and 4.17%, the relative bias was 0.19% and 0.66%, the recovery was 95.4-101.5%, the sensitivity was 1.13 pg/ml; the linear range of TNF- was 1.07-1111.11 pg / ml, the intra-assay of variation was 2.67% and 2.90%, the inter-assay of variation was 4.27% and 4.91%, the relative bias was 0.85% and 1.53%, the recovery was 97.3-104.2%, the sensitivity was 1.07 pg/ml; the linear range of MCP-1 was 7.07-3333.33 pg / ml, the intra-assay of variation was 2.63% and 2.92%, the inter-assay of variation was 3.70% and 4.23%, the relative bias was 0.15% and 1.06%, the recovery was 95.2-104.3%, the sensitivity was 7.07 pg/ml. The high levels of triglyceride, cholesterol and bilirubin had a certain interference to detection, the low levels of triglyceride, cholesterol and bilirubin had a minor disturbance, and it had no significant difference with ELISA. Conclusion Cytometric bead array multiplex detection method to detect IL-6, TNF- and MCP-1 can be used in the clinical and expansion of flow cytometry.【Key words】Cytometric bead array; Multiplex detection; IL-6、TNF-;MCP-1.目前，冠心病（coronary artery heart disease, CHD）已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病1。近年来的研究，明确了血管壁的炎症性变化在冠状动脉粥样硬化及其并发症的发生进展过程中发挥了非常大的作用。许多炎症性因子，如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）等炎性因子参与了动脉粥样硬化的形成过程。随着流式细胞技术的不断普及，对同一标本进行多参数的流式微球联合检测，具有广阔的应用前景。本文利用微球荧光编码技术，结合流式细胞分析技术，建立了IL-6、TNF-和MCP-1的流式微球联合检测分析技术，具有灵敏度高，特异性强，节约成本等特点。1 材料和方法1.1 标本来源 血浆标本采自2010年9月2011年3月贵州省人民医院心内科已确诊的心肌梗死患者和健康体检者。清晨空腹采血，分离血浆，-80保存待检。1.2 主要仪器和试剂 IL-6、TNF-和MCP-1标准品，IL-6、TNF-和MCP-1鼠抗人单克隆抗体（浓度均为100g/ml），IL-6、TNF-和MCP-1生物素标记的羊抗人二抗（浓度均为0.2mg/ml），以上均为美国R&D公司产品，荧光素（FITC）标记羊抗鼠IgG（abcam公司，2mg/ml），羧基化微球（Bio-Rad公司），PE标记的亲和素（eBioscience公司，0.2mg/ml），甘油三酯标准品、 胆红素标准品和胆固醇标准品（天津一方科技有限公司），人IL-6、TNF-和MCP-1 ELISA检测试剂盒（R&D公司产品，批号分别为CK-E10140H、CK-E10110H和CK-E10136H），BD Array流式细胞仪、酶标仪等。1.3 方法1.3.1 试验条件的选择分别取100l三种已用不同荧光素标记的羧基化微球，参考文献2激活微球，分别在浓度系列依次是0g、1.25g、2.5g、5g、10g、20g的三种鼠抗人单克隆抗体加入25ug/ml的FITC标记羊抗鼠IgG50l，反应后通过流式细胞仪检测荧光强度中位数MFI（median fluorescence intensity），制着剂量反应曲线，选择适宜的鼠抗人单克隆抗体最佳联接量。按文献2的方法进行微球偶联。用正交试验对生物素标记抗体地的释倍数、孵育时间、洗涤次数、PE标记的亲和素的稀释倍数、标记了亲和素后的第二次孵育时间和洗涤次数等验条件进行优化。1.3.2 方法学评价应用CLSI的有关规则对流式微球分析技术检测IL-6 、TNF-、MCP-1的线性、精密度、准确度、灵敏度、回收实验、干扰试验和方法学对比等分析性能进行系统性评价3。1.4 统计学处理采用SPSS13.0统计软件设计正交试验表和统计学分析，方差分析、2检验和两组间比较以P0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1 流式微球联合检测方法学的建立经过试验发现，荧光强度中位数MFI随着鼠抗人单克隆抗体的增加而增加，考虑试剂成本及试验的有效性，IL-6、TNF-和MCP-1单克隆抗体的最佳连结量均为10g。根据正交试验结果，利用SPSS3.0软件分析，IL-6、TNF-、MCP-1流式微球检测条件优化为：试验体系中，生物素标记抗体的稀释倍数为1:540、第一次孵育时间为2h、第一次洗涤次数是2次、PE标记亲和素的稀释倍数选择1:1000、第二次孵育时间选择1h、第二次洗涤次数为1次。以羧基化微球标记的不同的荧光素为定性基础，按优化的试验条件选择实验参数，按仪器说明书操作，即建立了流式微球联合检测IL-6、TNF-和MCP-1的分析技术。2.2 灵敏度试验：对自建方法进行灵敏度试验， IL-6检测灵敏度为1.13pg/mL，TNF-检测灵敏度为1.07pg/mL，MCP-1检测灵敏度为：7.07pg/mL。2.3 线性实验：按自建的流式微球联合检测法检测IL-6、TNF-、MCP-1标准品系列稀释浓度，结合灵敏度试验， IL-6在浓度1.133333.33pg/ml，其线性良好，曲线相关系数为0.9999，曲线方程为：y=0.8361x+100.88。TNF-在浓度1.07-1111.11pg/ml，其线性良好，曲线相关系数为0.9969，曲线方程为：y=0.2571x+105.50。MCP-1在浓度7.07-3333.33pg/ml，其线性良好，曲线相关系数为0.9989，曲线方程为：y=0.4696x+91.71。2.4精密度试验： 按自建的方法对不同浓度的IL-6、TNF-、MCP-1稀释样品进行精密度试验，IL-6低高两个稀释浓度标准品（4.57 pg/mL和123.46pg/mL）的批内变异系数分别为2.31%、1.98%，批间变异系数分别为4.17%、3.52%；TNF-低高两个稀释浓度标准品（4.57 p g/mL和123.46 p g/mL）的批内变异系数分别为2.67%、2.90%，批间变异系数分别为4.27%、4.91%； MCP-1低高两个稀释浓度标准品（13.72 ng/mL和370.37 pg/mL）的批内变异系数分别为2.63%、2.92%，批间变异系数分别为3.70%、4.23%。2.5 准确度试验：根据自建方法，选择IL-6标准品浓度为4.57 pg/mL和123.46pg/mL，TNF-标准品浓度为4.57 p g/mL和123.46 p g/mL, MCP-1标准品浓度为13.72 ng/mL和370.37 pg/mL进行验证试验，IL-6的相对偏倚分别为0.19%和0.66%，回收率是95.4101.5%； TNF-的相对偏倚分别为0.85%、1.53%，回收率是97.3104.2%；MCP-1的相对偏倚分别为1.06%、0.15%，回收率是95.2104.3%。2.6干扰实验：取病人血浆，加入不同浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素作干扰试验，高浓度的甘油三酯（37mmol/L）、胆固醇（13mmol/L）和胆红素（0.34 mmol/L）混合干扰物对IL-6、TNF-和MCP-1测定时的干扰率分别为12.1%、11.6%和9.4%，对检测有一定的干扰。较低浓度的甘油三酯（18.5mmol/L）、胆固醇（6.5mmol/L）和胆红素（0.17mmol/L）混合干扰物对IL-6、TNF-和MCP-1测定时的干扰率分别为6.7%、5.8%和3.4%，对检测干扰较小。2.7方法对比实验：80份血浆标本中IL-6、TNF-、MCP-1水平采用自建方法和ELISA法试剂试剂盒同时进行检测，对检测数据采用配对t检验， t值分别是0.44、1.09和0.94， P值均大于0.05，两种检测方法无显著差异。3 讨论许多炎症性因子，如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）等参与了动脉粥样硬化的形成过程4,5。在炎症性标志物的检验中，方法较多，常用的有酶联免疫吸附试验、放射免疫试验、免疫比浊等。ELISA法影响因素较多，而且存在着标准化问题。放免法由于存在放射性污染问题，在临床上的应用也逐渐减少。免疫比浊法对抗体和增浊剂的质量要求很高，试剂和仪器较贵6。近年来，流式细胞分析技术（Flow Cytometer，FCM）已广泛应用于临床，应用前景不断扩大，发展流式微球分析技术（cytometric bead assay, CBA），则检测所需样本量更少，并大大缩短操作时间，同时其特异性强，灵敏度高，如果将多种荧光强度具有明显差异的微球, 分别用不同的特异性抗体包被, 将包被好的微球(捕获微球) 混合, 并与标准/或待检样本及荧光素标记的特异性检测抗体一起反应, 可对样本中的多种可溶性细胞因子或蛋白质同时进行CBA定量，从而进行流式微球的多参数联合检测分析。本文就编码不同的羧基化微球，建立的对IL-6、TNF-和MCP-1的流式微球联合检测方法。对于一个检验方法或检测系统的建立，为保证检验质量，确保检测系统的有效性，必须对检测系统进行系统性评价，评价的主要内容包括几大性能，如分析灵敏度、线性、精密度、准确度干扰试验及方法比对等。只有真正验证了检测系统的分析性能符合临床要求，或与公认的