09汞胁迫对水稻生长及幼苗生理生化的影响

天津农学院2006届毕业生优秀论文集 - 19 汞胁迫对水稻生长及幼苗生理生化的影响马 勇（指导教师：刘惠芬）（天津农学院农学系02级农学班，天津300384）摘 要： 通过水培试验，研究汞胁迫下水稻的生长指标包括株高、分蘖和根冠比的变化以及生理生化指标包括叶绿素含量、游离脯氨酸含量及SOD、POD、CAT等保护酶活性的变化。结果表明，重金属汞对水稻株高、分蘖具有抑制作用，随着汞离子浓度的增加，生物量、叶绿素含量显著下降。另外，汞胁迫可激发保护酶活性，使保护酶含量增加。但汞胁迫对叶片相对含水量及脯氨酸含量的影响不显著。关键词： 汞胁迫；水稻；水培Abstract：The hydroponics was adopted in our experiments to research the effects of heavy metal Hg on the growth characteristics, including plant height, tiller, the ratio of root/shoot and the physiological and biochemical characteristics including the content of chlorophyll and free proline and the protective enzyme activity of SOD、POD、CAT. The results showed that Hg restrained the height and tiller number of paddy. With Hg2+ concentration increasing, the content of chlorophyll and biomass dropped obviously. In addition, Hg2+ could induce the protective enzyme activity. But the effect of Hg2+ on relative water content of leaves and the content of free praline showed no significant difference.Key words: Stress of hydrargyrum; paddy; hydroponics我国是一个水资源严重短缺的国家，人均水资源占有量排在世界第109位，仅为世界平均水平的1/4。尤其是近年来，工农业及城市用水激增。其中，农业用水量占全国总用水量的70%左右，而农业用水主要是水稻用水，约占农业用水量的90%。农业用水供需矛盾日益突出，干旱缺水成为制约我国农业发展的主要因素之一。解决水资源紧缺的关键:一方面要大力推行节水灌溉技术，例如喷灌、微灌、渗灌等。另一方面应加强对污水的利用，转害为利、变废为宝，从而节省水资源，促进水资源及农业的可持续发展1。但是，目前我国的污水处理技术相对滞后，一些污水未经处理便直接排入河流湖泊之中，被污染的水又直接用于灌溉。这在我国北方一些城市周边地区表现尤为突出。以天津地区为例，天津市耕地拥有地表水资源为0.39万m3/hm2仅为全国公顷平均水量的14.8%，因此天津只能引污水灌溉。目前全市污灌面积已达11.91万hm2，占污灌区、县面积的75.1%，占全市耕地面积的27%。其中全污灌面积为0.828万hm2,占总面积的7.2%，清污混灌的面积8.19万hm2占总面积的71.29%，间歇污灌面积为2.469万hm2占总面积的24.49%2。污水中的主要污染物之一就是重金属污染。重金属污染是指比重大于5.0 (主要包括Cu、Zn、Cd、Pd、Hg、Cr、As、Ni、Co)的金属或其化合物在土壤环境中所造成的污染。汞则是几种主要的重金属污染物之一。污水中的汞主要来源于氯碱工业、塑料工业、汞电池工业和电了工业所排放的废污水3。上世纪80年代以来，汞作为全球性污染物已受到全世界关注。土壤中的汞超过一定水平就会在植物体内积累。汞是人类食物链中毒性最强且易于富集放大的有毒物质，特别是有机形态的汞，由于水生生态系统（湿地、沼泽、稻田）是产生甲基汞的重要场所，通过植物的富集和食物链的放大，对高级生物的生存状况和人类的健康构成严重威胁20。植物体内的汞主要来源于土壤，喷施农药、用杀菌剂处理种子和污水灌溉也是农作物中汞的主要来源。一般来说，存在于土壤中的低剂量汞会促进植物的生长和发育，并不产生危害作用。据中国和日本的盆栽试验表明，当土壤中Hg含量高达25-50mg/kg时，才会使农作物的生长发育受到危害。土壤中的汞对植物的危害，主要是植物根功能受到伤害，进而抑制根的生长以及阻碍根对营养成分的吸收作用，当根受到土壤汞的毒害后，根部扭曲，呈褐色，有锈斑，根系发育不良。相应地，地上部分的叶子发黄，植株变矮，甚至枯死。粮食作物中吸收汞的能力的大小顺序为：水稻玉米高粱小麦。有人根据试验求得，对于水稻，酸性土壤汞的最高允许含量为0.5mg/Kg，石灰性土壤为1.5 mg/Kg 。从一些污染地区调查来看，土壤中汞对水稻糙米的残留量比较大，而对小麦等旱作物的影响较小，因此在汞污染的农田，可改为旱田，种植小麦等作物4。汞污染严重危害人类的健康。日本著名的水俣病的发生就是与食用含甲基汞的鱼等食物有关。任何形式的汞均可在一定条件下转化为剧毒的甲基汞，甲基汞有一甲基汞、碘化甲基汞和二甲基汞。环境湿度、pH值、汞的浓度等均能影响汞的甲基化。无机汞和有机汞均能在生物体内富集，通过生物富集和食物链大大提高了汞的危害性。汞蒸汽可通过呼吸道侵入人体，迅速通过细胞膜进入血液并能通过而脑屏障进入组织，被氧化成二价汞离了在脑组织中蓄积，引起汞神经系统症状。甲基汞进入人体后遍布全身各组织器官中，主要侵害神经系统，尤其是中枢神经系统5，6。到目前为止，人们对汞污染对水稻的影响的研究不是很多，所以本试验将起到一定的理论指导作用。基于前人的研究经验，本试验以水稻为研究对象，通过水培的方式对水稻进行不同浓度的汞胁迫处理，从生理和生化等方面研究重金属汞对水稻的影响机理。1 材料与方法1.1 试验材料 供试水稻品种：中作931.2 试验设计取均匀一致的水稻幼苗移栽到白瓷缸中，每缸七株。用1/2Hoagland培养液培养一周，取长势一致的幼苗组成18缸，对应加入0，0.5，1，5，10，50mg/L汞离子浓度的1/2 Hoagland营养液进行培养，所对应处理分别用CK，T1，T2，T3，T4，T5表示。试验设置3个重复，施入重金属溶液10天及17天后分别调查株高（取对角线三株）和分蘖数（个/盆）。两周后，取倒2、倒3叶测定叶绿素含量、脯氨酸含量、POD活性、SOD活性、CAT活性、叶片相对含水量。之后每缸取4株测生物量（克/盆），另3株继续培养，待收获后测生物量及穗重（克/盆）。1.3 试验方法1.3.1 叶绿素含量测定7每个处理取水稻倒数第二叶，精确称重，放入研钵中加少量石英砂和1mL 80%丙酮研磨成糊状，过滤，用80%丙酮冲洗残渣至白色为止，定容50mL。吸取丙酮提取液，用722型分光光度计进行比色，测量440nm，645nm，663nm下的吸光值。 叶绿素含量=色素浓度（C）提取液体积稀释倍数/样品鲜重（或干重） 利用公式计算：单位(mg/L)Ca = 12.70D6632.69D645 Cb= 22.90D6454.63D663 Ca+b = 20.2 D645+8.02D663 Ck= 4.7 D4400.27 Ca+b 1.3.2 脯氨酸含量测定81.3.3.1 绘制脯氨酸标准曲线 称取10mg脯氨酸溶于少量乙醇中，用蒸馏水定容100mL，制成100mL母液。取母液0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 mL分别放入11个50mL的容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容，配成一系列溶液。分别取上述溶液各2mL，加入已编号的试管中，再分别加入2mL冰乙酸，4mL酸性茚三酮试剂，2mlL3%磺基水杨酸。摇匀后，在沸水中加热显色60min，取出后冷却至室温，向各试管加入4mL甲苯，在振荡器上振荡，以萃取红色产物。萃取后经静置，使红色物质全部转入甲苯层。用滴管轻轻吸取红色的甲苯溶液于比色杯中，在分光光度计520nm波长处测定吸光值。以脯氨酸含量和吸光值绘制标准曲线。1.3.3.2 游离脯氨酸的提取 精确称取0.2g叶片材料，剪碎后放入具塞试管中，加2mL水，2mL冰乙酸和4mL酸式茚三酮试剂。摇匀后，在沸水中加热显色60min,取出后冷却至室温，加入4mL甲苯，充分振荡，以萃取红色产物，于分光光度计520nm波长处测定吸光值。1.3.3.3 计算样品中脯氨酸的含量脯氨酸含量（g/gDW）= 查得脯氨酸数g/mL提取液总体积mL/样品重g1.3.3 酶液制备精确称取各处理的倒数第二叶0.2g左右，加入1/15M，pH7.8的磷酸缓冲液1mL，研磨成匀浆，用4mL分次冲洗转移至离心管中，4000r/min离心10min，上清液即为备用酶液。1.3.4 过氧化物酶（POD）活性的测定愈创木酚法9 反应液（50mL 0.1M pH6.0 PBS+28L愈创木酚）2mL，加入酶液50L和200L H2O2加入H2O2后混合均匀，1min后立即在470nm波长下比色，室温，记下吸光度，重复2次，以愈创木酚溶液作对照。（每分钟OD470增加0.01为一个酶活性单位U,酶活性以U/g FW/min） 酶活性计算公式：POD活性(U/gFW/min)= OD470/鲜样重g反应时间min1.3.5 过氧化氢酶（CAT）活性的测定高锰酸钾法10吸取酶液100L放入三角瓶中，加反应液（100mL 0.05M pH7.0 PBS+90L H2O2）5mL，室温反应1min，立即加2mL10%的H2SO4终止酶反应。用标定过的2mmol/L KMnO4滴定剩余的H2O2至粉红色在半分钟内不消失，重复两次。求出两次平行的平均滴定值。根据H2O2的消失量计算CAT活性。酶活性单位为mol/gFW/min。 酶活性计算公式：CAT活性（mol/gFW/min）= 40-2mmol/L KMnO4滴定量mL/ 鲜样重g反应时间min1.3.6 超氧化物岐化酶（SOD）含量的测定111.3.6.1 配制反应液：300mLPBS（1/15M，pH7.8）加入0.58克甲硫氨酸，0.147克核黄素，0.01116克乙二胺四乙酸，使用前暗处加入0.0154克氮蓝四唑（NBT）。1.3.6.2 取两支试管，分别加入SOD反应液3mL和1mL1/15M的PBS（pH7.8）。其中一支立即在560nm处做对照调零，另一支在30用4000Lux的光照照射10min，之后立即测定该反应液在560nm下的透光率（OD值）。1.3.6.3 加入1mL酶液（酶液50uL加1/15M PBS(pH7.8)950uL稀释20倍），暗光下加入3mL反应液，在30、4000Lux的光照下光照10min后颜色出现变化，立即停止光照，测定560nm处的吸光值。以抑制50%为一个酶活力单位（u）,以u/g表示。样品的酶活力=(S-A)/(B-A)/2*N S:样品光照后的透光率N:稀释倍数A:未加酶的反应液光照后的透光率B: 未加酶的反应液光照前透光率1.3.7 叶片含水量的测定13剪取植株由顶部起的第二叶作为样品。取1-2片样叶，称其鲜重(Fresh weight，FW)，65烘干24h，称其干重（Dry weight，DW）。含水量LWC=(FW-DW)/FW100%。1.3.8 生物量测定 分别收获地上和根两部分，根要用清水冲洗干净，用吸水纸吸干水分。然后分别称其鲜重.置于105烘箱中烘30min，再于70烘干24h，降至室温分别称其干重。1.3.9 数据分析采取SPSS系统分析软件对测定的各个指标进行单因素完全随机设计的方差分析（P0.05），采用DUNCAN进行平均数的比较。2 结果与分析2.1 汞对株高的影响不同浓度汞处理10天和17天后对株高的影响差异显著（见表1）。方差分析两次调查结果表明，低浓度处理对株高增长有促进作用，高浓度处理则显著降低株高。表 1 汞对水稻株高的影响（单位：cm）处理处理10天株高处理17天株高CKT1T2T3T4T550.441.39 ab50.562.27 ab55.116.19 a44.677.42 bc41.673.78 c37.672.52 c55.673.60 a59.893.34 a59.224.07 a59.336.55 a44.891.95 b37.443.29 c2.2 汞对分蘖的影响不同浓度汞处理10天和17天对分蘖的影响见表2。方差分析两次调查结果表明，低浓度处理对水稻分蘖影响不明显。高浓度 T4显著降低分蘖，T5虽然分蘖降低不显著，但无效小、弱分蘖增多。2.3 汞对穗重的影响不同浓度处理组的平均穗重见表3。从表3可以看出，T1处理产量高于对照，可能是低浓度处理刺激植物的结果。之后，随着浓度的增加，穗重逐渐下降。表 2 汞对水稻分蘖的影响处理处理10天（个/盆）处理17天（个/盆）CKT1T2T3T4T522.332.51 a23.331.53 a22.003.46 a18.331.53 a13.002.00 b20.063.79 a22.672.52 a23.671.15 a23.003.60 a19.001.53 a13.002.08 b22.003.21 a表 3 汞对水稻产量的影响处理穗重CKT1T2T3T4T510.774.1 ab11.280.74 a6.760.42 ab6.173.53 ab8.900.23 ab5.144.40 b2.4 汞对生物量及根冠比的影响不同浓度汞对水稻生物量及根冠比的影响见表4。由表4可以看出，汞对第一次收获的生物量影响低浓度时不显著，当浓度达到T4、T5时，显著降低生物量。低浓度汞对第一次收获的根冠比影响显著，随浓度增加，根冠比增大。这说明随着浓度增大，汞对茎叶的抑制作用要大于对根的抑制作用。低浓度汞对第二次收获的生物量影响不显著，但T1处理的生物量仍然最大，再一次说明低浓度的刺激作用。而低浓度汞对第二次收获的根冠比影响不显著。表 4 汞对生物量及根冠比的影响（生物量单位：g）处理第一次收获生物量第一次收获根冠比第二次收获生物量第二次收获根冠比CKT1T2T3T4T57.291.74 a7.731.60 a7.120.94 a8.101.80 a3.532.29 b4.931.31 b0.450.07 abc0.380.01 c0.420.05 abc0.410. 12 bc0.540.09 ab0.560.03 a25.236.19 a30.735.48 a27.161.34 a29.761.61 a29.961.61 a25.861.45 a0.490.07 a0.480.14 a0.390.07 a0.480.14 a0.540.20 a0.740.08 a 2.5 汞对叶片相对含水量和脯氨酸含量的影响汞对叶片相对含水量的影响见表5。从表中数据可以看出，不同浓度汞处理对叶片相对含水量没有影响。同样，不同浓度汞处理对叶片脯氨酸含量没有影响。2.6 汞对叶绿素含量的影响光合作用是植物物质积累的基础，植物体内发出的叶绿素萤光与光合作用各种反应过程密切相关。叶绿素和类胡萝卜素是影响植物光合速率的重要因素。植物体内的叶绿素水平可以作为衡量光合能力强弱的一个指标。汞会影响植物的光合作用19。不同浓度处理下的水稻幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和类胡萝卜素的含量见表6。分析表中数据可以看出，不同浓度处理的叶绿素b，类胡萝卜素的含量与对照相比均不显著。而叶绿素a和叶绿素a+b在低浓度处理时其含量均高于对照，说明低浓度汞对其有促进作用。高浓度对叶绿素a起到抑制作用13。表 5 汞对叶片相对含水量（%）和脯氨酸含量（g/gDW）的影响处理叶片相对含水量脯氨酸含量CKT1T2T3T4T5660 a661 a661 a672 a654 a661 a231.9151.68 a282.4932.07 a271.73136.19 a206.81128.22 a298.2955.19 a238.0842.96 a表6 汞对叶绿素含量的影响（叶绿素含量单位mg/gFW）处理叶绿素a叶绿素b叶绿素a+b类胡萝卜素CKT1T2T3T4T51.670.14 b1.760.16 ab1.790.17 ab2.220.49 a1.620.38 b1.400.12 b0.760.08 a0.770.05 a0.790.09 a0.710.02 a0.680.02 a0.570.08 a2.430.21 ab2.530.21 ab2.570.26 ab2.920.26 a2.300.58 b1.970.20 b0.180.02 a0.130.02 a0.160.03 a0.090.01 a0.300.02 a0.260.02 a2.7 汞对叶片中CAT、POD、SOD活性的影响CAT、POD、SOD均为植物体内的保护酶，在防止自由基伤害中起着重要作用。CAT能消除细胞内过多的过氧化氢，能维持其在一个低水平，从而保护膜的结构7。POD是植物体内抗性生理中研究较多的酶，它能分解植物体内过多的过氧化物。SOD能有效清除植物体内氧自由基对细胞膜的毒害。不同浓度汞处理对CAT、POD、SOD的影响见表7。由下表7可以看到，CAT、POD活性总体上变化不明显，但均在T4时达到较高值，说明高浓度处理会激发其活性。一般认为作物叶片中二者活性随着浓度增加而增加。SOD活性先是随着浓度增加而后又下降，这一结果前人研究汞对玉米影响时所得结果基本一致16，17。3 讨论本试验研究结果表明：汞胁迫水稻后，低浓度处理对株高增长有促进作用，高浓度处理则显著降低株高，汞浓度的增加对株高抑制作用越来越明显。低浓度处理对水稻分蘖影响不明显。高浓度 T4显著降低分蘖，T5虽然分蘖降低不显著，但无效小、弱分蘖增多。而在高浓度下是否会刺激无效分蘖这一结果，有待与进一步研究。对穗重的影响也是低浓度处理对穗重增长有促进作表7 汞对叶片中CAT、POD、SOD活性的影响处理CAT活性（umol/gFW/min）POD活性（umol/gFW/min）SOD活性（u/g）CKT1T2T3T4T5130.734.80ab126.000.90b131.522.02ab128.435.53ab133.217.03ab135.403.92a0.730.25b0.610.13b0.640.17b0.640.09b1.110.19a0.790.19b9.011.50b10.863.14b26.561.05a9.113.96b13.003.49b9.355.10b用，高浓度处理则显著降低穗重，汞浓度的增加对穗重抑制作用越来越明显。说明汞污染环境条件下能严重影响水稻产量。这与一般认为汞能抑制农作物生长发育, 导致产量下降的结论一致 14, 15 。从汞对根冠比的影响可以看出，汞对茎叶的抑制作用可能要高于对根的影响。脯氨酸是植物重要的渗透调节物质，它的积累有着对逆境适应的意义9。因此其含量