分子生物学课件005.ppt

第五章分子生物学研究法,重组DNA技术,1重组DNA技术是基因工程的核心技术2获得需要的目的基因（外源基因）3构建重组质粒和基因克隆4转化受体细胞和转化子的筛选5转化子的分析Southern杂交,重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。所谓基因工程(geneticengineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,1重组DNA技术是基因工程的核心技术,重组DNA操作一般步骤：,（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。,2获得需要的目的基因（外源基因）,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,细胞破碎,从植物组织提取基因组DNA一、材料水稻幼苗或其它禾本科植物二、设备移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。三、试剂1、提取缓冲液：100mmol/LTrisCl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。2、提取缓冲液：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP（聚乙烯吡咯烷酮），240ul巯基乙醇，加水至300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇4、RnaseA母液：配方见第一章。5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。,操作步骤：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液,60水浴预热。2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。4.室温下5000rpm离心5分钟。5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6.在1.5mleppendorf中加入1mlTE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。9.加入5lRNaseA(10g/l),3710分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。10.加入1/10体积的3mol/LNaAc及2体积的冰乙醇,混匀,-20放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。12.将DNA重溶解于1mlTE,-20贮存。13.取2lDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取15l稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。注意5g样品可保证获得500gDNA,足供RFLP、PCR等分析之用。,重组DNA工具酶,限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶缺口平移制作标记DNA探针合成cDNA的第二链填补双链DNA3凹端DNA序列分析耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶等）聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3末端加入同质多聚物尾SI核酸酶绿豆核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端DNA端酶降解DNA，在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解除RNA磷酸酶切除核酸末端磷酸基核酸酶核酸外切酶（exonuclease）：是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)：是从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。DNA限制性内切酶粘性末端配对重组同裂酶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。,基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题费时费事内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,如何研究内含子在基因表达中是否有功能？,聚合酶链式反应（PCR）,PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得230（1.07109)个基因片段,聚合酶链式反应示意图,PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授,1988年发明了PCR技术1993年获得诺贝尔奖,该技术的限制因素？,70年代末分离到DNA聚合酶,基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。,3构建重组质粒和基因克隆,限制性内切酶,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。,限制性内切酶,已经发现和鉴定了200多种,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶,载体,载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、质粒等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。,以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆,将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1获得目的基因和质粒载体；2形成重组质粒；3制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。,32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物,4转化受体细胞和转化子的筛选,DNA操作技术,核酸的凝胶电泳：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶：不同大小的核酸在同一浓度的凝胶中迁移率不同，因为分子越大其受的阻力越大，迁移率与碱基对的对数值成反比；同分子量不同构象的核酸迁移率也不同，超螺旋环状DNA迁移率线状DNA迁移率带切口环状DNA迁移率。,琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖浓度与分离片断大小的关系2浓度：一般PCR产物使用，1浓度：0.5Kb-10Kb的DNA使用，0.3%-0.7%浓度：基因组DNA使用。聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓度与分离片断）：4.0浓度：1000100bp10.0浓度:500-25bp20.0浓度:50-1bp,染料：溴化乙锭（EtBr）,核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。,核酸分子杂交,细菌转化,受体菌直接摄取供体菌DNA片段并整合到自己的基因组中，从而获得新的遗传性状的过程。,转导,噬菌体的结构,噬菌体侵染细菌过程,吸附,注入,合成,组装,释放,转导transduction,概念：以噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段转移到受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状。,核苷酸序列分析,快速测定核酸序列有许多方法：Sanger双脱氧链终止法。MaxanGilbert化学修饰法。DNA序列分析的自动化。DNA杂交测序法。RNA序列测定方法与DNA测序法的原理是一样的。,每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs处,5,Sanger双脱氧链终止法,反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显色指示.,3CCTTTAGCT5,四个化学裂解反应产物经凝胶电泳分离后的寡核苷酸阶梯,G反应：DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，吡啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后吡啶置换了嘌呤。T+C反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被吡啶所置换。C反应：在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被吡啶置换。,杂交测序,自从70年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。,DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤首先是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列。,DNA与蛋白质相互作用研究,DNA结合蛋白的检测和纯化：1凝胶阻滞试验(gelretardation)分析DNA结合蛋白亦称凝胶移动变化测定(gelmobilityshiftassay-EMSAorbandshiftassay),可以鉴定DNA与蛋白质结合的情况，将标记的DNA小片段与蛋白质混合进行PAGE电泳，不结合蛋白质的DNA泳动较快，结合蛋白质的DNA则滞留而缓慢移动。,放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带,放射自显影,*,*,*,*,凝胶电泳,放射性标记的DNA,细胞蛋白质提取物,蛋白质与DNA结合,*,*,*,*,*,*,B,DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢,滞后带表明DNA与蛋白质结合,凝胶阻滞实验的基本原理图,蛋白质与DNA相互作用,2DNase足迹法:DNase足迹试验足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位.DNase足迹试验的原理:蛋白结合在DNA片段上保护结合部位不被DNase破坏。这样蛋白质在DNA片段上留下了足迹在电泳凝胶的放射性自显影图片上相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带,32p,1510,*,14810,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,AB,足迹,(a),(c),(b),DNaseI足迹试验,基因克隆的主要载体系统,1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞4.安全性,大肠杆菌载体pBR322结构图,载体特点,基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。,质粒DNA及其分离纯化,细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链DNA组成的复制子，也有线性质粒的报道。,质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。,应用质粒作为基因克隆的载体分子，最重要的前提是要获得大量纯化的质粒DNA分子。,Ecoli的质粒种类1)colE1因子（大肠杆菌素因子）多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。2)R因子（抗药性因子）可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便3)F因子（性因子）,质粒载体DNA的分离关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开原理：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型,变性法：变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNARF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）,氯化铯密度梯度离心法,实验表明，在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒DNA的纯化是十分有用的。,上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥,碱变性法,通过氯化铯-EtBr密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康。原理：实验观察发现，在pH值介于12.012.5的条件下加热DNA溶液，使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。,重要的大肠杆菌质粒载体,1.pSC101质粒载体,pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。pSC101质粒不仅具有可插入外源DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，其产量就要比其它质粒载体低得多。,2.ColE1质粒载体,ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到10003000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。,3.pBR322质粒载体,为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号、又具有低分子量、高拷贝、以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。,pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tertr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。,第一个优点：具有较小的分子量，其长度为4,363bp。由于分子量小，不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,pBR322质粒载体的优点,4.pUC质粒载体,pUC系列质粒载体包括如下四个部分：(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶的单识别位点；(iii)大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；(iv)位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，它并不破坏该基因的功能。,第一，更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子缩小了许多，如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。同时，由于rop基因缺失，使pUC8质粒的拷贝数比带有pMB1或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多，不经氯霉素扩增，平均每个细胞即可达500700个拷贝。第二，可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。第三，具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。,pUC质粒载体优点：,5.pGEM-3Z质粒,pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子质粒载体，总长度为2,743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。pGEM-3Z具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应试管中加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM-4Z和pGEM-3Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、取向相反而已。,6.穿梭质粒载体,所谓穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector），是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。早期发展的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体，大多是由这两种细菌的质粒载体融合构建的。例如，pHV14是由pBR322和pC194融合而成，pEB10是由pBR322和pUB110融合而成的。,大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有两种分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记。它使研究工作者可以自如地在这两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种寄主细胞中研究目的基因的表达活性及其它调节功能。例如，可将酵母的某种基因亚克隆到穿梭质粒载体上，置于大肠杆菌中进行定点突变处理后，再把突变体基因返回到酵母细胞，以便在天然寄主中观察研究此种突变的功能效应。,大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,噬菌体载体,噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。,我们将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。而溶源生长周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫作温和噬菌体。,以噬菌体DNA分子作载体，克隆含有目的基因的外源DNA片段，如果没有导致重要的噬菌体基因失活，那么当这种重组的噬菌体DNA分子感染了寄主细胞之后，插入的外源DNA片段便会随着噬菌体DNA分子一道增殖。用放射性同位素32P标记的特异性探针作噬菌斑放射自显影杂交，可以十分敏感地检测出含有这种重组体DNA分子的噬菌斑（即阳性斑点）。获得了阳性噬菌斑之后，我们就可按照类似于制备质粒DNA的方法，分离到大量的重组体噬菌体DNA，实现克隆基因的扩增。,噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。,在噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5-P和3-OH基团封闭起来，并进一步超盘绕。这种粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesive-endsite，粘性末端位点.,1插入型载体外源的DNA克隆到插入型载体分子上，就会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，插入型载体又可以进一步被分为免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活两种亚型。(1)免疫功能失活插入型载体。这类载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种限制性核酸内切酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会破坏载体所具有的合成功能性阻遏物的能力，阻碍其进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。(2)-半乳糖甙酶失活插入型载体。许多种载体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编码-半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染大肠杆菌的lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lacz区段上，阻断了-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。,2.替换型载体替换型载体又叫作取代型载体（substitutionvector）是一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。在构建此类载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。,“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。在柯斯质粒载体pHC79中，除cos位点之外，其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列。质粒DNA部分则是一个完整的复制子，包括一个复制起点和两个抗菌素抗性基因ampr和tetr。很明显，pHC79柯斯质粒兼具了噬菌体载体和pBR322质粒载体两方面的优点，其克隆能力为3145kb，而且能够被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。,柯斯质粒载体,第一，具有噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，能按照噬菌体DNA同样的方式环化。第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此能像质粒DNA一样在寄主细胞内进行复制，并且能在氯霉素作用下，获得进一步扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。第三，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有57kb左右。因此，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成噬菌体颗粒的最大外源DNA片段，即柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。,柯斯质粒载体的特点：,pBluescript是专用的商品名称，系指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。,pBluescript噬菌粒载体,(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii)编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。,5.4基因的分离与鉴定,克隆：多细胞的高等生物个体水平上:表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体，所以说，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。在细胞水平上:指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。基本步骤：(1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化；(2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；(3)将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；(4)重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。,克隆基因的分离,1、应用核酸探针分离克隆目的基因2、应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因3、应用cDNA差示分析法克隆基因4、应用酵母双杂交体系克隆基因5、基因的图位克隆法6、DNA微列阵技术进行基因克隆,基因克隆的第一步是要从实验材料中制备包括“目的基因”在内的DNA片段群体，而且这个DNA片段群体必须包容整个基因组的全部序列，DNA片段的大小要适合于基因操作的要求。最简单的办法是利用限制性核酸内切酶消化供体基因组DNA，并直接将消化产物与载体分子相连接。这个被称为鸟枪法（shot-gunapproach）的方法最明显的缺点，是所形成的重组体分子带有大小不同的插入片段。由于高等真核生物的基因组庞大，按一般载体承受外源DNA插入能力（大约为10003000bp）计算，能产生几十万个大小不同的DNA片段，形成由几十万个大小不同的重组体分子组成的克隆群体。要想从如此巨大的群体中，选出带有目的基因的克隆，显然是十分费事的。为了克服上述困难，有人建议采用局部双酶消化法，保证DNA产物大小在10-30kb左右，通过蔗糖梯度离心或制备凝胶电泳技术，得到分子量约为20kb的随机群体并将其克隆到合适的载体上。,1DNA片段的产生与分离,2重组体DNA分子的构建,5.4.2.1.外源DNA片段定向插入载体分子若用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化一种特定的DNA分子，将产生具有两种不同粘性末端的DNA片段。因此，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对限制性核酸内切酶切割，那么，载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子，从而保证外源DNA片段定向插入载体分子。事实上，载体分子和外源DNA插入片段（或称供体DNA），并不一定总能产生出互补的粘性末端，所以，有时采用平末端连接法或采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。,5.4.2.2.最佳连接反应,为了使连接反应物中的外源DNA片段都能插入载体分子形成重组DNA，必须设法阻止经限制性内切酶切割后的线性载体分子的自身再环化作用，以提高DNA片段的插入效率。目前常用碱性磷酸酯酶处理由内切酶消化产生的线性载体分子，除去该DNA的5-P末端，而留下一个5-OH基团。经碱性磷酸酯酶处理过的线性载体分子，除非插入了外源DNA片段，否则就不再能够重新环化成有功能的载体分子。在连接反应中，正确地调整载体DNA和外源DNA之间的比例，是能否获得高产量重组转化子的一个重要因素。应用噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值的载体DNA/供体DNA的连接反应体系有利于重组分子的形成。以柯斯质粒载体为例，因为只有当给体DNA片段的两个末端都同柯斯质粒载体结合之后，才能被有效地包装。若使用质粒分子作为克隆的载体，其重组体分子由一个载体分子和一个给体DNA片段连接环化而成，所以，当载体DNA与供体DNA的比值为1时，有利于这类重组体分子的形成。,5.4.2.3.重组体分子导入受体细胞的途径,转化（或转染,转导、,显微注射,电穿孔,原核细胞和酵母等低等真核细胞,高等动物的真核细胞,核生物基因组DNA十分庞大，而且含有大量的重复序列。因此无论是采用电泳分离技术还是通过杂交的方法，都难以直接分离到目的基因片段。这个问题可以通过由mRNA产生的cDNA进行克隆而得以部分解决，因为尽管高等生物一般具有3-5万种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有15%左右的基因得以表达，产生出约5000-10000种不同的mRNA分子。cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。,5.4.3cDNA基因克隆,5.4.3.1.高质量mRNA的制备,可应用PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。,IsolationofmRNA,RNA提取,分离mRNA,5.4.3.2.反转录生成cDNA,可同时在反转录系统中加入寡聚（dT）及随机引物R6，以保证得到全长cDNA，应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，保证所获得双链cDNA的方向性。因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-methylC的外源DNA，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株。选用cDNA克隆这一实验方案时必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。在组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量是极不相同的，有些mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些mRNA的含量很低，每个细胞只有几个拷贝。根据mRNA分子含量的多寡，即我们所说的丰富程度（简称丰度），可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度三种不同的类型（表5-3）。,OligodT或随机引物合成cDNA第一链,合成cDNA第二链,补平cDNA链末端,从表中看出低丰度mRNA，每个细胞仅有14个拷贝左右，其总量约占总mRNA的30%，其中约有11,000个左右的不同种类的mRNA。因此，为了获得一个能够代表全部低丰度mRNA序列的cDNA基因文库，必须的最低克隆数（理论值）应是11,000/0.30=37000。但由于在实验中存在着取样上的差异，有些序列容易被克隆，有些序列却不容易被克隆，为了保证基因文库中能够包含所有的序列，就必须增加克隆的数目。为了使上述低丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期望率，大约需要筛选170,000个克隆。,5.4.4克隆基因的分离,5.4.4.1.应用核酸探针分离克隆目的基因把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。此法的最大优点是应用广泛，而且相当有效，适用于大规模筛选。只要有现成可用的核酸探针，我们就有可能从任何生物体的任何组织中分离目的基因，也就能够有效地检测任何一种插入的外源DNA序列，而不以这种序列能否在大肠杆菌细胞中表达为前提。,5.4.4.2.应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因,根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keepinggene），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因（developmentalregulatedgene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differentialexpression）。,1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P.Liang和A.D.Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示PCR（mRNAdifferentialdisplay）技术，简称DDRT-PCR，可以从一对不同基因型的细胞群体所产生的约15,000种mRNA中有效地鉴定并分离出差别表达的基因。,DDRT-PCR的主要操作步骤如下：（1）从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA；（2）用5随机引物和某个3端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；,（3）用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；（4）回收特异性差别条带；（5）用同一引物对扩增已回收的DNA条带；（6）用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；（7）以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。,5.4.4.4.应用酵母双杂交体系克隆基因,酵母双杂交体系也叫interactiontrap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质相互作用的基因。研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、