第九章 微生物学的研究方法

第九章微生物的研究方法,由于生产实践中必须结合特定的问题进行具体分析，同时目前对微生物的研究还远远不能满足生产中的要求，尤其是处理特殊物质的微生物筛选、驯化等还需要进一步进行试验研究，因此掌握微生物的研究方法，学会微生物的分析及其他研究方法是十分必要的。,一、微生物的观察,微生物的观察是对微生物进行分析的先决条件。由于微生物非常小，必须用显微镜进行观察，微生物的观察有普通显微镜观察法与电子显微镜观察法两种。常用的普通显微镜又有明视野型、暗视野型、相差型之分，以下是他们的一些区别之处。(详细内容请查阅实验指导）常用显微镜比较,二、微生物的培养和分离,分离的目的：得到纯种的微生物，进行研究。点名提问：如何进行微生物的分离？粗分可用选择性培养基进行筛选，要分离到单一的细菌必须进行划线分离。,划线分离是在培养皿中进行的。用接种针或接种环蘸一环生物样品，在无菌的固体培养基平板上进行连续划线，划线实质上是将接种环（针）上的细菌以不断稀释的方法接种到平板上，划的方法如下图所示，随着划线时间的延长，被粘连在平板上的细菌越来越多，而接种环（针）上的细菌越来越少，接种上去的细菌越来越稀疏，最后必然能实现接种上单一的细菌。,划线后进行培养，在划线末端接种上的单个细菌会繁殖出一个同源的细菌菌落，这种菌落就是我们所需要的单菌落。接种环（针）是由白金丝或电炉丝按在一个铁棒上制成。如图接种针前端被窝呈圆形就是接种环。,分纯后的细菌可用于进行驯化或基因改良，培养出高效的细菌。通过富集培养就可以投放到生物处理反应器中。值的注意的是由于生物体系复杂的相互关系，生物之间除了共生外，同时还存在竞争和拮抗关系，因此高效细菌在实践中的处理效果常常要小于实验水平，解决这一技术问题是目前生化处理的研究热点之一。,三微生物的保藏与复壮,高效细菌在研究过程中以及在实践应用中总需要有一部分进行保藏作为种子，但菌种的保藏中存在一个细菌变异的问题，变异是细菌的特点，随时都在发生，虽然有些变异可以使细菌的处理性能提高，但大多数情况下则正相反，菌种的性能发生衰退。提问：如何解决？答案：出现衰退之前分离出没有发生衰退的细菌并富集培养，即所谓的复壮，继而再保藏、复壮、保藏克服菌种的退化现象，使菌种在生产中保持相对的稳定。,（一）菌种的保藏,原理：用低温、干燥、缺氧、贫乏培养基和添加保护剂等，使微生物处于代谢极微弱、缓慢，生长繁殖受抑制的休眠状态。保藏方法有如下几类：,1定期移植法此法简便易行，不需要特殊设备，能随时发现所保存的菌种是否死亡、变异、退化和受杂菌污染。斜面培养、液体培养及穿刺培养均可。保存的温度和时间各菌种不一。例如，细菌于46保存，芽孢杆菌每36个月移植一次，其他细菌每月移植一次。若贮存温度高，则移植间隔时间要短。放线菌于46保存，每3个月移植一次；酵母菌于46保存，每46月移植一次；霉菌于46保存，每6个月移植一次，于20保存，则2周需移植一次。,2干燥法将菌种接种到干燥载体上，如河沙、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以砂土保藏法用得较普遍，通常把接种菌种的砂土放在干燥器内，于常温或低温下保藏，芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、放线菌及霉菌均可用此法保藏。,（一）菌种的保藏,3隔绝空气法该法是定期移植法的辅助方法。如，用液体石蜡封住半固体培养物来保藏菌种。将待保存的斜面菌种用橡皮塞代替原有的棉塞塞紧，这样可使菌种保藏较长时间。原理：抑制微生物代谢，推迟细胞老化，防止培养基水分蒸发，从而延长微生物的寿命。,4蒸馏水悬浮法这是一种最简单的保藏法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好便可达到目的。如球衣菌就可用此法保藏。,（一）菌种的保藏,利用低温、干燥和隔绝空气等几个保藏菌种的重要方法的综合作用。A.先用保护剂制成细胞悬液(细菌悬液含细胞数目以每毫升1081010个为宜)并分装于安额管内其中的保护剂有牛奶、甘油等，作用是进入细菌细胞保护细菌细胞在冷冻、低温水分升华时细胞组织足够的强度，不致使细菌受到伤害。B.将悬液冻结成冰(温度为25至40)。抽气进行真空干燥，样品水分大量升华，待样品水分升华95以上时，目视冻干样品呈现酥状或松散的片状即可。C.对安领管进行熔断封口，置室温或低温保藏均可。这种方法可使菌种稳定保藏几年至十几年，是最好的保藏方法。,5综合法（冷冻干燥法）,此外，还有其他菌种保藏方法，可参阅菌种保藏手册。,菌种退化的原因有以下两种：一种是由于变异引起的；另一种是由于“衰老”引起的。1变异衰退与复壮一般的变异都是衰退变异复壮方法：稀释分离分离出尚未变异的菌株，进行培养，获得原有特性的菌种。预防：由于环境因素如营养物浓度、高温等都会提高变异的频率因此控制环境影响因子适当的水平可以减缓变异衰退的发生。,（二）、菌种的衰退与复壮,2自然衰老与复壮,与核酸变异无关的生理机能的衰退都归为自然衰老提问：为什么细菌会衰老？原因：可能与代谢废物或有毒物质在细胞内积聚有关。复壮方法：由于机理不清，这种衰退目前还没有一个很好的复壮方法预防：避免使保藏的细菌传代过多是目前唯一预防方法。除了对衰退菌种进行分离复壮外，用高剂量的紫外辐射和低剂量的诱变剂联合处理对于衰退严重的菌株可以起到满意的复壮目的。,四、灭菌,灭菌是指杀灭包括芽孢在内的全部微生物的操作。它与消毒的区别在于，消毒不能杀死芽孢，灭菌可以。目的:避免在微生物研究过程中纯的菌种受到污染菌种污染影响结果的可靠性，必须对使用的培养基和用具进行严格的灭菌处理。常用的灭菌方法有干热法、湿热法、灼烧法。,（一）干热法干热法是在烘箱中利用热空气进行灭菌的方法，一般在160170烘烤2h可起到灭菌的目的。这种方法常用于金属和玻璃器皿的灭菌处理。（二）湿热法湿热法是在高压蒸气灭菌锅中用湿热的水蒸气进行灭菌的方法，一般采用一个大气压（121）持续1520min，可起到灭菌的目的。液体培养基、试验用具等常常用这种方法灭菌处理。对于含有葡萄糖、乳糖等易被高温破坏物质的培养基，温度则降低为115持续30min进行灭菌处理。（三）灼烧法灼法法是用火焰将微生物烧死的方法，这种方法只用于接种环、接种针、载玻片、试管孔及不再使用物品的灭菌。病死牲畜也常用此法处理。,四、无菌操作不仅研究中使用的物品会污染菌种，研究人员的操作不慎也会污染菌种，如衣服、毛发、手、口腔等的细菌都会因操作时的疏忽污染菌种，因此必须注意实验操作中的无菌操作。包括操作间的紫外杀菌、手臂的消毒、操作中的火焰保护等，尽量避免这类人为污染的发生。,复习思考题,请为本章出35道