单克隆抗体技术及其应用ppt课件

.,单克隆抗体技术,.,1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。单克隆抗体（monoclonalantibody）：针对预定抗原的同一抗原决定簇的，高度同质的，且能保证无限量供应的抗体。单克隆抗体技术的理论依据：抗体的多样性、克隆选择学说、抗体基因的重排理论、抗体结构与生物合成机制。,单克隆抗体技术简介,.,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,实验原理杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是：骨髓瘤细胞：可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。脾细胞（B淋巴细胞）：它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。,细胞融合技术：,长命不分泌抗体,分泌抗体短命,分泌抗体长命,将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的骨髓瘤细胞与经免疫的脾细胞进行融合。杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。,杂交瘤细胞筛选的原理：,HAT培养基筛选,.,杂交瘤技术的操作流程,一.动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,特定目标抗原,动物,免疫,脾脏中B淋巴细胞,B淋巴细胞大量增殖,刺激,能分泌针对于该抗原的特异性抗体,.,杂交瘤技术的操作流程,一.动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,细胞融合方法,1.病毒介导的细胞融合2.聚乙二醇（PEG）介导细胞融合3.电激融合,融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，,.,杂交瘤技术的操作流程,一.动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,要求：简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品,1.酶联免疫吸附法2.间接免疫荧光法3.放射免疫法4.双相扩散法,常用方法：,酶联免疫吸附法(ELISA),技术原理：,待检杂交瘤培养上清液,.,杂交瘤技术的操作流程,一.动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,常用克隆化方法,有限稀释法软琼脂平板法显微操作法,80个细胞/96孔饲养细胞(feedercells),ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。,.,杂交瘤技术的操作流程,一.动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,.,1、单克隆抗体的制备：,获得杂交瘤细胞,动物细胞培养,提取单克隆抗体,将抗原注入小鼠体内获得效应B淋巴细胞,效应B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,用特定培养基筛选出杂交瘤细胞,筛选能够产生所需抗体的细胞群,再在培养液或小鼠腹腔中培养,从培养液或小鼠腹水中提取,.,骨髓瘤细胞（SP2/O-Ag14）：,单克隆技术的原理,丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）无法在HAT选择培养剂中生长能无限地快速增殖既不合成轻链又不合成重链,小鼠脾细胞（B-Cell）：,合成和分泌特异性抗体无法进行体外长期培养,脾细胞SP2/O融合细胞：,HGPRT，能在HAT选择培养剂中生长能无限地快速增殖合成和分泌特异性抗体,HAT,.,单克隆抗体制备原理,-,-,-,-,-,.,.,AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.58,1,2,3,4,1,2,3,4,单克隆抗体,细胞融合,取出脾细胞,+骨髓瘤细胞,x,传统抗血清（多克隆抗体）,抗原,免疫,1,2,3,4,B细胞,抗原免疫小鼠後，其脾臟會產生分泌抗體的各種B細胞。,每種B細胞只能分泌一種抗體，對抗各自的抗原決定基。傳統抗血清便是所有抗體的混合，得以有效保護動物個體。,假如能够把单一B细胞挑出来培养，则可收获单抗。但是，B细胞无法常规培养。,癌細胞可以在試管中持續培養生長，但無法產生所要的抗體。,这些单独的融合细胞可以大量生产单一种抗体，即单克隆抗体。,若把B细胞与癌细胞融合，所得到的融合细胞可分别培养。,.,单克隆抗体制备过程（示意图）,细胞融合的方法：1、仙台病毒2、PEG/DMSO3、电融合,.,严格进行无菌操作，防止污染（细菌、霉菌、支原体、细胞）根据实验的目标及时进行细胞的检测与筛选，（ELISA、IFA、凝集、中和，）对筛选得到的阳性细胞克隆进行早期单克隆（有限稀释法）在单克隆细胞建株过程中不定期验证检测防止单克隆细胞过度生长老化死亡,单克隆抗体制备过程的注意事项,.,单抗,Monoclonalantibody由杂交瘤细胞系产生的，针对同一抗原决定簇的抗体高度均质。由同一个B细胞克隆产生的同异质的抗体组成，是针对抗原的单一决定簇抗体。单抗纯度高，专一性强、重复性好。无披次差异。易于标准化。能保证无限量供应。,单克隆抗体与免疫血清的比较,免疫血清,又称多克隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成，是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分特异性差。不同批次的抗体制剂质量差异很大。难以工业化批量制备。,.,多克隆抗体(Polyclonalantibody),给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗体。抗原决定簇：是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope)。,.,.,单克隆抗体技术的应用,2、