第一专题-生物大分子的结构与功能.ppt

第一专题,生物大分子的结构与功能,第一章,核酸的结构和功能StructureandFunctionofNucleicAcid,目录,第一节核酸的种类、分布和化学组成第二节核酸的分子结构第三节核酸的理化性质及其应用第四节核酸的制备、测定及研究技术,核酸(nucleicacid),核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸的发现和研究工作进展,1868年FridrichMiescher从脓细胞中提取“核素”1944年Avery等人证实DNA是遗传物质1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年Nirenberg发现遗传密码1975年Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA测序方法1985年Mullis发明PCR技术1990年美国启动人类基因组计划(HGP)1994年中国人类基因组计划启动2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架,第一节核酸的种类、分布和化学组成,一、核酸的生物学功能二、核酸的种类和分布三、核酸的化学组成,一、核酸的生物学功能,or,and,肺炎球菌转化实验,生物学的中心法则,二、核酸的种类及分布,RNA主要存在于细胞质中，约占90%，少量存在于细胞核。RNA有三种：信使RNA（mRNA），占总RNA5%。核糖体RNA（rRNA），占总RNA80%。转移RNA（tRNA），占总RNA10-15%。,真核,98%核中（染色体中）,核外,线粒体（mDNA）,叶绿体（ctDNA）,原核,拟核,核外：质粒（plasmid）,病毒：DNA病毒,三、核酸的化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成：CHONP,A、G、C、U（RNA)A、G、C、T(DNA),核糖（RNA）脱氧核糖（DNA）,两类核酸的基本化学组成,（一）戊糖,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为D-核糖。,(二）碱基,1.嘌呤（Purine）,2.嘧啶（Pyrimidine）,CH3,稀有碱基,除上述5种基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的碱基，通常称为稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,N,N-二甲基腺嘌呤：m2,6,6,6,A,（三）核苷,核苷戊糖+碱基糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,AdenosineGuanosineCytidineUridine,核酸中的各种核苷,几种稀有核苷,6,A,）,（m2,N,N-二甲基腺嘌呤,6,6,（四）核苷酸,腺嘌呤核苷酸（AMP）Adenosinemonophosphate,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosinemonophosphate,鸟嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,OH,H,腺嘌呤核苷酸（AMP）,鸟嘌呤核苷酸（GMP）,尿嘧啶核苷酸（UMP）,胞嘧啶核苷酸（CMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）,（五）细胞内游离核苷酸及其衍生物,多磷酸核苷酸环化核苷酸辅酶类核苷酸,1.多磷酸核苷酸,2.环化核苷酸,cAMP(cGMP)的结构,3.辅酶类核苷酸,VitB2,FMN,AMP,FAD,第二节核酸的分子结构,一、DNA的分子结构二、RNA的分子结构,一、DNA的分子结构,（一）DNA一级结构（二）DNA碱基组成的Chargaff规则（三）DNA的二级结构（四）DNA的三级结构,（一）DNA一级结构,DNA的一级结构是由数量极其庞大的四种脱氧核苷酸，dAMP,dGMP,dCMP,dTMP通过35-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多核苷酸链。DNA分子中核苷酸的排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列。一级结构的走向规定为53。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息,3-5磷酸二酯键,核酸分子中核苷酸之间的共价键,一级结构表示法：结构式，线条式，字母式,5pApTpCpGpCpT-OH3,字母式,线条式,（二）DNA碱基组成的Chargaff规则,Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在年总结出DNA碱基组成的规律：1.同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；2.同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；3.几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同A=T，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同G=C，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同AG=CT。4.不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在AT/GC比值的不同。这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。,（三）DNA二级结构,双螺旋结构,1.DNA双螺旋结构的研究背景,碱基组成分析Chargaff规则：A=TGC,碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理,DNA纤维的X-光衍射图谱分析,2.DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,（1）DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链构成双螺旋结构。两条链围绕同一个“中心轴”形成右手螺旋，螺旋表面有一条大沟和一条小沟。（2）嘌呤碱和嘧啶碱层叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，碱基之间的堆积距离为0.34nm。磷酸与脱氧核糖在外侧，彼此之间通过磷酸二酯键连接，形成DNA的骨架。糖环平面与中轴平行。,2.DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,（3）双螺旋的直径为2nm，顺轴方向每隔0.34nm有一个核苷酸,两个核苷酸之间的夹角为36，因此，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸。（4）一条多核苷酸链上的嘌呤碱基与另一条链上的嘧啶碱基以氢键相连，匹配成对，配对的原则是A=T之间形成二个氢键，GC之间形成三个氢键。因此，DNA的一条链为另一条链的互补链。,碱基的配对,AT,CG,3.DNA双螺旋结构的稳定因素,氢键碱基堆集力碱基处于疏水环境中带负电荷的磷酸基与带正电荷的阳离子形成离子键,4.DNA双螺旋结构的多态性,Z-DNA,B-DNA,A-DNA,三种DNA双螺旋构象比较,ABZ,外型粗短适中细长,螺旋方向右手右手左手,螺旋直径2.3nm2.0nm1.8nm,螺距2.8nm3.4nm4.5nm,碱基夹角333660,每圈碱基数111012,碱基对间垂直距离,0.255nm0.34nm0.37nm,碱基对倾角2007,大沟很窄很深很宽较深平坦,小沟很宽、浅窄、深较窄很深,5.三链DNA,DNA分子内的三链结构,（四）DNA的三级结构,DNA双螺旋进一步扭曲成三级结构。,1.DNA的超螺旋结构,某些小病毒、细菌的质粒、噬菌体、真核生物线粒体和叶绿体以及某些细菌染色体中的DNA为双链环形，其三级结构为麻花状超螺旋形式。,DNA超螺旋的形成,超螺旋的拓扑学公式：L=T+W,超螺旋状态的定量描述,公式1：L=T+WL连环数，DNA双螺旋中一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数。TDNA分子中的螺旋数W超螺旋周数或扭曲数,公式2：=（L-L0）/L0超螺旋度L0松驰态DNA连环数如上述超螺旋DNA的L=23L0=25，=-0.08,DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,DNA超螺旋结构形成的意义,2.DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。,核小体的组成DNA：约200bp组蛋白：H1H2A，H2BH3H4,各2分子,核小体的直径10-11nm，DNA分子在组蛋白核心外面缠绕约17.5圈，有大约160bp。连接核小体的DNA片段约为32-34bp,核小体盘绕及染色质示意图,二、RNA的分子结构,（一）RNA一级结构和类别（二）tRNA的分子结构（三）rRNA的分子结构（四）mRNA的分子结构,（一）RNA的类别和一级结构,信使RNA（messengerRNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用；核糖体RNA（ribosoalRNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所；转移RNA（transforRNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,RNA分子中各核苷之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构,RNA与DNA的差异DNARNA糖脱氧核糖核糖碱基AGCTAGCU不含稀有碱基含稀有碱基,（二)tRNA的分子结构,二级结构特征：单链三叶草叶形四臂四环,三级结构特征：在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型,tRNA的二级结构三叶草形,3,5,氨基酸臂DHU环反密码环额外环TC环,tRNA的三级结构倒L形,*,真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA,原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA,rRNA的种类（根据沉降系数）,（三）rRNA的分子结构,结构特征：单链，螺旋化程度较tRNA低与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5SRNA的二级结构,（四）mRNA的分子结构,内含子(intron),*mRNA成熟过程,外显子(exon),*mRNA结构特点：,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构,帽子结构,帽子结构,OCH3,mRNA由核内向胞质的转移mRNA的稳定性翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,*mRNA的功能把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,其他小分子RNA,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。,snmRNAs,第三节核酸的理化性质及其应用,一、核酸的一般性质二、核酸的紫外吸收性质三、核酸的变性、复性和分子杂交,一、核酸的一般性质,1、性状：DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，DNA分子粘度大于RNA。核酸变性后，粘度下降。,3、溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，两者都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。核酸的提取？,4、核酸的酸碱性质核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,二、核酸的紫外吸收性质,1、光吸收：紫外吸收波段：240290nm最大吸收峰：260nm2、变性后的光学性质：（1）增色效应：与天然DNA相比，变性DNA因其双螺旋结构破坏，使碱基充分外露，因此，紫外吸收增加，这种现象叫增色效应。（2）减色效应：若变性DNA复性形成双螺旋结构后，其紫外吸收降低，这种现象叫减色效应。,DNA的紫外吸收光谱,天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值,123,OD260的应用,1.DNA或RNA的定量,RNA浓度（ug/mL）=,OD260,0.022XL,X稀释倍数,DNA浓度（ug/mL）=,0.02XL,OD260,X稀释倍数,式中：OD260为260nm波长处光密度值；L为比色杯的光程，一般为1cm；0.022为每毫升溶液含1微克RNA的光密度；0.02为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。,2.判断核酸样品的纯度,DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,三、核酸的变性、复性和分子杂交,（一）变性（二）复性（三）核酸的分子杂交,(一）变性,1、DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。2、DNA变性的本质：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。3、导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲醛等，均可引起核酸分子变性,DNA的变性过程,加热,部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对,4、变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,Tm：熔解温度,DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在7085之间。,DNA的Tm值与下列的因素有关：,1、DNA的均一性:均一性愈高的样品，熔解过程的温度范围愈小。2、G-C的含量：（G-C）%=（tm-69.3）x2.443、介质离子强度：介质离子强度较低，DNA的tm也低。,（二）复性,DNA复性(renaturation)：变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,（三）分子杂交,当两条不同来源的DNA链或DNA链与RNA链之间存在互补顺序时，在复性时可发生碱基互补配对形成局部双螺旋区，称分子杂交Southern杂交（Southernbolting）Northern杂交（Northernbolting）Western杂交（Westernbolting）,分子杂交的原理示意图,核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一。用来检验核酸的缺失、插入；制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。,核酸杂交及其应用示意图,.变性、复性和杂交粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链,.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡,.粗线代表探针粗线上的X表示放射性标记,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,第四节核酸的制备、测定及研究技术,一、核酸制备的一般原则二、核酸的制备三、核酸的测定方法四、核酸的研究技术,一、核酸制备的一般原则,因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。,（一）核酸制备时应遵循两个原则：,保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。,（二）核酸的纯度要求,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。,（三）核酸制备的注意事项,尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学物质对核酸的降解(避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏)；防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；,减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。,机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,破碎细胞,提取,纯化,二、核酸的制备,(一）核酸制备的一般方法和原理,1、核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,RNase抑制操作要带手套所有器皿要严格消毒试剂处理低温操作在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂,2、核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,3、核酸制备中常用的蛋白质变性剂,蛋白质变性剂的作用：（1）使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。（2）使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。（3）某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,4、核酸提取的一般过程,（1）破碎细胞微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,（2）抽提核酸除去杂质,a首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离；b使核酸与蛋白质分离；c除去脂类；d多糖的除去。,（3）核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,（4）核酸质量的鉴定,DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,a.应用OD260：,b.琼脂糖凝胶电泳,（5）核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是温度和介质温度：-70是长期保存的良好温度，为一次性保存。-20保存。保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0,（二）注意事项材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,（二）注意事项细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠,（二）注意事项核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,（二）注意事项核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,（三）DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶切和PCR反应。,原因,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,对策,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,（三）DNA提取常见问题,问题二：DNA降解,原因,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,对策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,（三）DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少,原因,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,对策,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,三、核酸的测定方法,RNA浓度（ug/mL）=,OD260,0.022XL,X稀释倍数,DNA浓度（ug/mL）=,0.02XL,OD260,X稀释倍数,式中：OD260为260nm波长处光密度值；L为比色杯的光程，一般为1cm；0.022为每毫升溶液含1微克RNA的光密度；0.02为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。,1、紫外吸收法,2、定糖法,RNA的测定：RNA分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680nm波长下进行比色测定。DNA的测定：DNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620nm波长下进行比色测定。,3、定磷法,RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在650-660nm进行比色测定。,四核酸研究技术,（一）核酸的沉降特性,溶液中的核酸在引力场中可以下沉。在超速离心机造成的强大的离心力场中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速离心用于：,1、测定核酸的浮力密度；2、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：超螺旋DNA、闭环质粒DNA、开环及线型DNA，若样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。3、核酸的制备。,（二）核酸的凝胶电泳,凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,水平板电泳,（三）核酸的序列测定,DNA测序的基本战略：,设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。,1.Sanger双脱氧链终止法(酶法测序）,DNA的合成总是从5端向3端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3,5磷酸二酯键，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示：,引物,5,3,酶反应,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,GGC,GGCC,GGCCATC,GGCCATCG,GGCCATCGTTG,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,ACGT,电泳方向,GGCCATCGTTGA,GGCCATCGTTG,GGCCATCGTT,GGCCATCGT,GGCCATCG,GGCCATC,GGCCAT,GGCCA,GGCC,GGC,酶法序列分析的原理,DNA的测序仪示意图,computeranalysis,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,样品槽,凝胶中DNA移动方向,输入光学系统,激光器,2.化学法（Maxam和Gilbert）,这一方法的基本步骤为:,(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列,如下图所示：,DNA的化学测序示意图,反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼,1、G反应：用硫酸二甲酯（DMS）使鸟嘌呤上的N7原子甲基化。甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键在中