流式细胞仪的原理与应用2ppt课件

流式细胞仪的原理与应用TheprinciplesandapplicationsofFlowCytometry,焦鹏,.,2,流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。,概述,.,3,流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术,同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而大大提高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液,用计算机进行数据处理,从而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数,被誉为是细胞分析领域的“CT”。,.,4,流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。,流式细胞术是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技术。利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。,6,.,国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN-COULTER公司Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）综合型（又称大型机、分析型）除具备检测分析功能外,还具有高速细胞分选功能,多用于科学研究。,流式细胞仪的原理与应用,一流式细胞仪的原理二流式细胞仪在生物医学中的应用,.,8,流式细胞仪（FlowCytometer)研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量1973年世界第一台商用流式细胞仪FACSI（FluorescenceActivatedCellSorter）1980年中国第一台流式细胞仪FACSII北师大生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域,.,9,流式细胞仪的工作原理待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。,10,.,前向角散射，即FSC，与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。侧向角散射，即SSC，是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。前向光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小。荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。,.,11,流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。,.,12,13,.,鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包裹下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。,.,14,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,.,15,另外，通过选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FCM同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。,.,16,应用范围,凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。,.,17,流式细胞仪（FlowCytometer）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，而且还在不断增加。当然，细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征，将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activatedcellsorter,FACS）,.,18,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度快,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,细胞群体的均值和分布情况,分选感兴趣的细胞,.,19,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体,.,20,1流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测30006000个细胞,大型机可达每秒几万个细胞。2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即可区分。3前向角散射光（FSC）检测灵敏度：前向角散射光（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2m.5m。,流式细胞仪主要技术指标,.,21,4流式细胞仪的分辨率：这里的分辨率与其它地方的解释差异太大。通常，“分辨率”被表示每一个方向上的像素数量，分辨率越高图像越清晰。这里的分辨率是衡量FCM仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV来表示。如果一群含量完全相同的样本，用流式细胞仪测量，CV值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小，分辨率越高。一般的FCM在最佳状态时CV2%。这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5流式细胞仪的分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度和分选收获率。分选速度指FCM每秒从液体中提取所要细胞的个数。分选纯度指被分选出细胞中目标细胞所占的百分率。分选收获率指被分选出细胞占原来溶液中该细胞的百分率。,2流式细胞仪的基本结构,光学系统液流系统电子系统数据处理系统分选系统,19,.,23,经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长(短）波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。,流式细胞仪的光学系统,24,.,FACSCalibur流式细胞仪的光路图,25,.,我中心检测型流式细胞仪：BDFACSCalibur激光：488nm,633nm常用荧光标记：FL1：GFP;CFSE;FITC;AlexaFlouro488FL2：PE;PIFL3：7-AAD;PE-Cy5;PerCP;PerCP-Cy5.5;PE-Cy5.5;PE-Cy7FL4：APC;AlexaFlouro647一般检测项目：细胞凋亡检测细胞周期检测细胞内活性氧检测细胞表面标记检测细胞内因子检测,.,26,激光(Laser)荧光素与荧光FACS检测的信号参数,.,27,激光-,激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照单色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力激光波长:488nm,635nm,细胞微弱荧光快速分析的理想光源,.,28,FACSCalibur的激光系统,经常使用的荧光素,FITCFluoresceinisothiocyanatePEPhycoerythrinPerCPPeridininchorophyllproteinAPCAllophycocyaninPIPropidiumiodide,PerCP（470-670）,PE（488-575）,APC（635-660）,TexasRed（488-525）,PE-CY5.5（488-667）,PI（536-617）,FITC（488-525）,CommonLaserLines,荧光信号,荧光素标记特异抗体荧光素吸收激光能量，产生跃迁回到基态，荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，释放较入射光波长更长的光量子荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,双激光立体空间激发系统,双激光，两点激发，实现4色荧光分析最大程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，亦相应地扩大了仪器的应用领域,.,33,当细胞携带两种荧光素如PE和FITC,受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路,光谱重叠的校正,.,34,35,.,流式细胞仪可检测到的细胞参数,1前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。2侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。,36,.,3荧光强度（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出4或6个FL。,前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积侧向角散射（SSC,SideScatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性,RightAngleLightDetectorCellComplexity,ForwardLightDetectorCellSurfaceArea,IncidentLightSource,散射光信号,.,38,FSC和SSC两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。外周血细胞散射光双参数点图（裂解红细胞后）,.,39,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,使用不同荧光素标记不同单克隆抗体对细胞进行染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,荧光信号,双色直接染色,39,FACSCalibur流式细胞仪液流系统,40,.,43,液流系统：流动室、液流驱动系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。,.,44,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,流式细胞仪的电子系统,进行信号检测和分析当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受到激发,产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。数字信号传送到计算机，计算机把所测量到的各种信号进行处理、储存、作图、统计分析,将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。,强大的数据处理系统,Macintoshi系统，灵活多样的图形处理能力目前公认的最佳图像处理系统,使流式细胞仪的功能发挥更加完美。强大的软件支持，灵活方便的数据处理功能仪器自动校检软件FACSComp主软件CELLQuest全面的自动化临床应用软件：淋巴细胞自动检测软件SimulSET；MultiSET干细胞自动检测软件ProCOUNTHLA-B27；ModFIT；,.,47,流式细胞仪数据分析,根据分析目的不同，对制备好的样本在流式细胞仪上测量其光散射和荧光强度。一般在测样本前先应用荧光标准微球校准仪器，多色分析时还应进行颜色补偿，以避免多色荧光间信号的相互干扰。仪器校准后测量样本，每个细胞的光散射及荧光测量数据一般以列表或矩阵方式储存于计算机中，然后进行数据的显示、图象分析和结果统计处理，最终获得所分析细胞的信息，也可在测定的同时进行结果分析。,流式细胞仪数据分析,数据存储:ListMode,.,49,数据的显示储存的数据文件虽然易于加工、处理、分析，但由于数据大，又缺乏直观性，不利于观察各参数及其相互的关系。因此，将数据用图形显示更直观，然后再进行统计分析，这是FCM结果分析中最常用的分析方法。FCM数据显示通常有一维直方图、二维点图、二维密度图、二维等高图、假三维图等。,.,50,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,单参数直方图,.,51,单参数直方图,细胞相对数量,荧光信号相对强度值（对数）,图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）,.,52,图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞,.,53,双参数散点图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,双参数散点图,.,54,1.双参数散点图,.,55,双参数点图,.,56,2.二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,.,57,等高图和密度图分析,二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。,.,58,3.假三维等高图,.,59,三参数直方图,三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-）。,.,60,流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预设的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。,、样品分选,.,61,细胞分选的原理当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。,.,62,流式细胞分选的特点1.少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高（99%以上），速度快。目前，先进的流式细胞仪的分选速度可达25000个细胞/秒以上，比传统的分选速度提高了很多倍，原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个，则需要耗费10小时以上，分选后细胞的活力会受到很大的影响。2.可以同时进行多个Marker分选，正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向右偏转，即两路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。,.,63,3.不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度（如细胞体积）或荧光（如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原）散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态，那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。4.如果只是偶尔做几次细胞分选的话，用流式分选还是比较划算的，只需要准备样品和抗体，交纳一定的仪器使用费即可，不需要购买配套的设备。,细胞分选原理,3、配套设施,数据处理系统Macintoshi系统Autoloader自动进样系统：40管轮盘，软件支持，简单易操作，真正实现无人操作样本制备仪：免疫样本制备仪DNA样本制备仪,.,66,4、流式细胞仪的分类,.,67,.,68,大型机FACSVantageSE,多激光多波长八特征参数设计灵活高速分选单细胞点对点分选,.,69,台式机FACSCalibur,双激光：488nm/635nm四荧光六分析参数自动化程度高分析速度快灵活的设计细胞分选系统细胞富集系统,70,.,BDFACSDiva型流式细胞仪,三激光八荧光十参数分析自动补偿四通道分选点对点分选,71,.,BDFACSCount型流式细胞仪,最简化的样本处理过程，很好地防生物污染完善的自动采样，自动分析出报告系统，防人为因素干扰严格完整地质控及对照系统，确保结果的准确性，可靠性完善的CD4，CD8，CD3绝对计数系统专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪,72,.,BD：FACSAria型流式细胞仪,自助式液流车，高速分选，达到50000个细胞/秒使得分析速度提升到70000个/秒，两路或四路分选，分选收集装置可选细胞培养板，微管，12x75，15ml试管；智能化分选设定，软件控制；自动监控液流，具有报警功能,73,.,BDLSR型流式细胞仪,三激光，六荧光八参数分析固定校准,74,.,Beckman-Coulter公司FC500型,双激光五色七参数分析自动补偿Windows操作系统,75,.,德国PARTEC公司CyFlowML型流式细胞仪,三激光十三荧光十六参数可移动性强,76,.,德国PARTEC公司CyFlow型流式细胞仪,可选激光三荧光六参数分析两种荧光分析与绝对计数不需Beads,77,.,德国PARTEC公司PAS型流式细胞仪,可选多激光六荧光九参数分析细胞分选500/sec可选全自动组件可选CCD摄像机,4、流式细胞术样本来源及处理,流式细胞术样本来源流式样品的制备中应注意的几个问题荧光染色的步骤,流式细胞术样本来源,细胞悬液：培养细胞、细胞系灌洗液、体腔积液分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小实体组织：Medimachine(Medimachine系统是一套安全的,标准化的样本制备系统,可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离)病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本针吸组织：新鲜样本鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质,80,.,流式样品的制备中应注意的几个问题,荧光素和抗体的选择荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的荧光素，常用的荧光素有：测细胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。测细胞蛋白、抗体或抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。测细胞膜电位：Rho-123。测钙离子：Fluo-3。,81,.,抗体的选择：一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。,82,.,（二）样品的准备,评价一个样品制备的优劣，可有三个评价指标:细胞的密度，不能低于1106/ml非特异荧光，不超过1细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的团块。,83,.,流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可信，虽然与仪器操作者的水平有很大关系，但在很大程度上取决于样品制备的优劣。细胞密度太低，影响测试速度并造成测试参数调整的困难，尤其是在做DNA分析时，由于细胞太少，势必要提高样品的流速，人为地增大了G0/G1期的CV值，影响了结果的可靠性；非特异荧光强，则造成样品结果的假阳性；聚集体增多，尤其是肉眼可见的细胞聚集体，可造成流式细胞仪进样针的阻塞，影响仪器的性能，碎片可干扰测试结果，造成结果分析的困难。,84,.,85,.,荧光染色对照的设置,空白对照自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强实验样本特异荧光，即抗体F(ab)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光自发荧光同型对照（自发荧光非特异荧光）FMO,合适？,86,.,同型对照,同型对照（IsotypeControl）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型（即Fc段相同，F(ab)2段不同）与染色的单克隆抗体相同种属来源相同免疫球蛋白及亚型相同荧光素标记相同剂量和浓度但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（1）和IgG2a（2a），并分别标记FITC和PE,.,87,荧光染色染色步骤,表面染色：细胞表面抗原抗体反应溶血：溶解红细胞破膜：细胞膜打孔，使胞内染料渗入清洗：除去多余的染料及打孔剂胞内染色：细胞内抗原抗体反应清洗：除去多余的染料固定：固定细胞，准备上机分析,88,.,样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋,单细胞悬液,标记荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学分析,继续培养,二流式细胞仪的应用,淋巴细胞亚群分析凋亡分析细胞周期分析细胞因子分析血小板分析HLA-B27分析,90,.,FCM提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通过荧光抗体和抗原检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD分子)、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要的指导作用。,1、淋巴细胞亚群分析,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为ThT辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）TsT抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态辅助临床疾病的诊断探索疾病的发病机理、病程、预后监测、指导临床治疗方案免疫系统疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测肿瘤病人化疗后免疫力检测,SimulTESTIMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,样本使用EDTA抗凝全血，用血量600uL使用双色分析试剂使用SimulSET自动软件，进行样本的获取和分析SimulSET软件自动做质量检查，帮助发现样本运输、处理等过程中造成的错误医生报告T、B、NK淋巴细胞及Th、Ts百分含量和Th/Ts比值，并报告参考值范围,淋巴细胞分析SimulSET,CD45/CD14(LeucoGATE)：自动定义淋巴细胞的光散射门，并评估其有效性IsotypeControl(1/2a)：阴性对照，确定FL1和FL2的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体CD3/CD19：鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3/CD4：鉴别T辅助/诱导淋巴细胞CD3/CD8：鉴别T抑制/毒性淋巴细胞CD3/CD16+56：鉴别T淋巴细胞和NK细胞,淋巴细胞分型步骤,SimulTESTIMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,.,97,CD45/CD14LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性,IsotypeControl(1/2a)：阴性对照，确定FL1和FL2的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体,CD3/CD19：鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞,CD3/CD4：鉴别T辅助/诱导淋巴细胞,CD3/CD8：鉴别T抑制/毒性淋巴细胞,CD3/CD16+56：鉴别T淋巴细胞和NK淋巴细,.,103,BDSimulTESTIMK-LymphocyteKit(反向设门法双色淋巴细胞表型分析)健康中国人参考范围（使用SimunlSET自动软件）,正常参考值:,HIV感染,T淋巴细胞总数减少T细胞亚群比例倒置，Th/Ts1.0Th细胞(CD4+细胞)绝对计数200个/mlTs细胞增高NK细胞减少或活力下降B细胞正常,HIV感染,HIV感染,68%,3.6%,3.4%,6.7%,10%,8.9%,2、细胞凋亡分析,凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、能够引起染色体损伤的药物、细胞自身表达的一些受体分子等。,细胞凋亡的检测,细胞凋亡的主要检查手段形态学检查Ladders实验流式细胞仪检查,细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的凋亡，并可与坏死细胞区别。,110,.,流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。在凋亡诱导剂的作用下*细胞色素C和apaf1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；*细胞内酶改变：Caspase-3活化*细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI*细胞核DNA的断裂改变：TUNEL实验*凋亡相关蛋白：FasBcl-2,111,.,流式细胞术检测凋亡的研究内容1、线粒体功能2、DNA3、Caspases4、AnnexinVAssay5、DNAFragmentationAssays6、凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2,.,112,1、线粒体功能线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。,.,113,2、DNA含量DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光强度也不一样。G2M期DNA含量是G0G1的两倍，而S期介于两者之间。,但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全可以不用这种方法。,.,114,下图横轴代表PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。,细胞凋亡ActiveCaspases-3,细胞凋亡Caspases-3,.,117,磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将正常细胞、凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开,磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)联合PI法,118,.,结果判断：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡早期细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞、凋亡晚期AnnexinV/PI均高染。,119,.,应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色检测细胞凋亡时因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠。是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。,120,.,121,.,TUNEL法检测细胞凋亡实验原理,细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30的染色体DNA在Ca+和Mg+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。,细胞凋亡,细胞凋亡,.,124,流式细胞仪最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色（染料着色数量直接与细胞内DNA含量相关）。有相当多的对DNA有高亲合力的染料可用于此应用。而不同的染料与DNA分子结合的位点不同。当运用DNA结合荧光染料后，经流式分析可观察到一个有特征的图谱，那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。,3、细胞周期分析,细胞周期,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,细胞周期中各个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征,.,126,流式细胞术PI染色进行细胞周期分析的原理,PI,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞,.,127,当细胞没有进入分裂过程时（我们机体中的绝大部分细胞），它们处于细胞周期的G1期的位置上。因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。在G1期细胞中有一群细胞特别安静并且没有进入细胞循环的任何生物学特征，我们称这些细胞为G0期细胞。,.,128,当二倍体细胞被化学定量式DNA染料着色后并在流式细胞仪上分析，会观察到一个很“窄”荧光峰。它将出现在以荧光强度为X轴、细胞数量为Y轴的坐标上。因为G1期细胞具有相同的DNA含量，理论上G1期细胞的DNA含量荧光强度应当一致，并在直方图上的一个通道上出现信号（在直方图上出现一条G1期细胞的荧光直线）。如果流式细胞仪十分完美且DNA染料的特异性绝对专一，这种情况将会发生。而在实际中，流式细胞仪本身存在着许多变异性，此外DNA染料的着色也存在生物学的变异。因此，检测得出的G1期细胞的荧光分布正常的是呈高斯曲线分布。这种“钟”型分布与检测的变异相关。检测中的变异越大，高斯曲线的宽度越宽。有一个名为“变异系数”（CV）的指标用于描述峰的宽度。,.,129,分别显示了一个理想状态中一台完美的流式细胞仪无偏差检测的直方图（A）和实际分析得到的呈高斯分布的直方图（B）。在B图中，使用Dean和Jett多项式S期分析模型进行分析识别出的G1、G2和S期细胞分布。,4、细胞活化及细胞因子的检测,免疫调控病因研究：AIDS、肿瘤、自身免疫疾病T淋巴细胞亚群对病原体的反应能力机会感染时的细胞反应药物/疫苗疗效评估化疗时免疫状况评估免疫状况监测：移植、寄生虫病、毒理、营养、外伤,细胞因子的检测,细胞活化后，不同激活标记交替表达发生细胞增殖反应可以分泌细胞因子，引起一系列免疫反应,细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能调节方面发挥重要作用。细胞因子可以调