高效液相色谱最新版本ppt课件

,第十三章高效液相色谱法HPLC,分析化学(下，第三版),高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,主要内容,一、概述二、基本理论及条件选择三、各类高效液相色谱法四、影响分离的因素五、高效液相色谱仪六、超效液相色谱技术简介七、HPLC定量分析方法学考察八、HPLC应用,第一节概述,一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、高效液相色谱仪流程图四、特点,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段柱内径13cm，固定相粒径100m且不均匀常压输送流动相柱效低（H，n）分析周期长无法在线检测2HPLC：分离和分析柱内径26mm，固定相粒径流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱固定液极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF,续前,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5反相洗脱：强度因子S，见P291表13-5。水的洗脱能力为0。6.出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱7适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,（三）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,续前,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5正相洗脱：溶剂的洗脱能力主要参考极性参数P（见P290表13-3）。6.出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等,（四）离子对色谱和离子抑制色谱,1反相离子对色谱法（ion-pairchromatography）2反相离子抑制色谱(ion-presschromatography),1反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k3）适用：较强的有机酸、碱,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值酸性物质加入酸HActR，k碱性物质加入碱NH3H2OtR，k调节pH范围：3.08.0pH8.0破坏键合相与载体的结合pH3.0腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,分离类型选择,第四节影响分离的因素,一、分离度二、流动相三、洗脱方式,1,续前,2对流动相的要求：,1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度k=110k=25最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气,续前,3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）,图示,第五节高效液相色谱仪,HPLC仪器示意图,HPLC的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵液,分离,检测,记录,进样阀,进样,1泵：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用2进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀,进样阀,样品,装样,废液,淋洗液,至分离柱,六通阀,（）,（）,样品环,续前,3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光,光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,第六节超效液相色谱技术简介（UPLC）,.,.,.,.,.,原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要65分钟才能完成,.,LC/MS联用可容纳600个色谱峰,第七节HPLC定量分析方法学考察,准确度（回收率实验）精密度（重复性实验）检出限（3S/N）定量限（10S/N）线性范围（2个数量级）色谱系统适用性实验柱效（理论塔板数）分离度重复性拖尾因子,第八节HPLC的应用,药物分析,食品分析,环境分析,农药分析,例题,在反相色谱中，若以甲醇-水为流动相，适当增加甲醇的比例时，组分的容量因子和保留时间的变化为（）。A样品的k降低，tR降低B样品的k增加，tR增加C样品的k增加，tR降低D样品的k降低，tR增加,.,例题,在正相色谱中，若适当增大流动相极性，则（）。A样品的k降低，tR降低B样品的k增加，tR增加C相邻组分的增加D对基本无影响,例题,HPLC中的最佳流速uH与GC中的最佳流速uG比较结果是（）AuHuGBuHuGCuH=uG,例题,用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的办法是（）。A增加流动相中甲醇的比例B增加流动相中的水的比例C流动相中加人少量HAcD流动相中加人少量的氨水,例题,在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。A分子筛B硅胶C氧化铝D活性炭,例题,水在下述（）中洗脱能力最弱（作为底剂）A正相色谱法B反相色谱法C吸附色谱法D空间排阻色谱法,例题,键合相的键合基团的碳链长度增加后（）A极性减小B极性增大C载样量增大D载样量减小,例题,在分配色谱法及化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）A提高分配系数比B容量因子增大C保留时间增长D色谱柱柱效提高,例题,二极管阵列检测器与一般分光光度计的主要差别是（）A不需光谱扫描即可获得样品每个组分的吸收光谱B服从Lambert-Beer定律C复光照射样品，而后再分光D信号弱，需要累加,例题,内标对比法与内标一点法的区别是（）A不需要加内标物B不需要校正因子C进样量不要准确,例题,用反相HPLC测定样品中的芦丁含量，选对氨基苯甲酸为内标。方法如下：准确配制1mg/mL浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲酸对照溶液，精取芦丁对照溶液2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL，分别置于25mL容量瓶中，同时各加入内标溶液2.00mL，定容。各进样3次，进样量为10L。得芦丁色谱峰面积和内标物峰面积之比的平均值分别为1.43、2.86、4.29、5.37和7.16。精称样品0.2070g，溶解，定容于100mL容量瓶中。精取10.00mL于25mL容量瓶中，同时加入内标溶液2.00mL，定容。进样量为10L，3次进样得芦丁色谱峰面积与内标物峰面积之比的平均值为5.10，计算样品中芦丁的含量。,本章小结：,1、