生物芯片技术(3-LMJ)'

江黎明2012年10月,生物芯片技术,第十四章,BiochipTechnology,医学分子生物学实验技术药立波主编,第一节概述,一、生物芯片的概念,二、DNA芯片,一、基因表达谱研究,一、原位合成DNA芯片制作,二、DNA微阵列芯片制作,一、待测样品的准备,二、分子杂交反应,三、检测分析,第二节生物芯片的制作,第三节DNA芯片使用的基本流程,第四节蛋白质芯片,第五节生物芯片的基本操作和流程,二、DNA测序,三、基因突变检测,四、基因诊断,五、蛋白质芯片的应用,六、药物研发,目录,2020年5月3日1时29分,2,生物芯片(biochip)技术是20世纪90年代初期由分子生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而发展起来的高新技术，因既具有重大的学术价值，又具有明显的产业化前景，被评为1998年度世界十大科技进展之一。,生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。,生物芯片将会改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。,第一节概述,萨瑟恩提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交。,（EdwinMellorSouthern）,Southern杂交可以被看作是生物芯片的雏形。,2020年5月3日1时29分,5,桑格和吉尔伯特发明了现在广泛使用的DNA测序方法，并由此在1980年获得了诺贝尔奖。,（FrederickSanger）,（WalterGilbert）,生物芯片这个概念首先是由FredSanger和WalterGilbert提出的；解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、低通量等不足。,2020年5月3日1时29分,6,1989，StephenFodor(斯蒂文弗尔多)发明了高密度生物芯片和芯片阅读器，为生物芯片产业开创及发展奠定了良好的基础。,1992，Affymatrix公司Fodor小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。,2020年5月3日1时29分,7,1995，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片；将cDNA密集点样在玻璃片上，进行基因表达谱研究和SNP分析。,2020年5月3日1时29分,8,一、生物芯片的概念,指通过微电子和微加工技术，将大量已知序列的核酸或蛋白片段等，有序地组合在1CM2大小固相介质表面而构成的集成分析系统。可与标记的核酸或蛋白分子特异结合，实现对核酸、蛋白等生物组分的快速、高效、敏感的处理与分析。,狭义的生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。,广义的生物芯片还包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片、缩微化的实验室即芯片实验室。,2020年5月3日1时29分,9,生物芯片的基本原理与特征：,“芯片”特征：,“分子杂交”原理：,生物分子间的相互特异识别作用（如:DNA分子之间、蛋白分子之间、DNA与蛋白分子之间以及自组装单分子膜之间等）,高通量、高集成、并行化、微型化、自动化、连续化,2020年5月3日1时29分,10,根据芯片的用途可分为两大类,2020年5月3日1时29分,11,二、DNA芯片,又被称为基因芯片(genechips)、DNA阵列(DNAarray)、cDNA芯片(cDNAchips)、寡核苷酸阵列(oligonucleotidearray)等。,DNA芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面；,使用时与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析从而得出样品的遗传信息。,2020年5月3日1时29分,12,1.玻片型这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。,2020年5月3日1时29分,13,有此类产品研制能力的公司不多,如Affimetrix公司。,（一）从支持物来分主要有：,2.薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如CloneTech公司）。,2020年5月3日1时29分,14,3.微板型这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板（如PE公司等）。,2020年5月3日1时29分,15,4.集成电路型将杂交技术与微电子技术结合于一体，通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）,2020年5月3日1时29分,16,（二）根据制作方式可分为两大类：,2020年5月3日1时29分,17,原位合成芯片(syntheticgenechip)DNA微集阵列(DNAmicroarray）,基因芯片的制作方式,原位合成,直接点样,显微光蚀刻技术(光引导原位合成),分子印章法,分子印章法,针式点样,喷墨点样,压电打印法,2020年5月3日1时29分,18,第二节生物芯片的制作,一、原位合成DNA芯片的制作,(一)显微光蚀刻技术,支持物经化学处理,表面活性羟基(OH)连接光敏保护基(X),选用光刻掩模(M1)保护非聚合部位；,2.用激光点光源照射聚合部位,去除光敏保护基(X),暴露活性羟基(OH)；,3.加入单核苷酸(如dTMP)的亚磷酰胺活化端与活性羟基(OH)发生化学偶联,光敏保护非活化端；,4.更换掩模(M2)，激光点光源照射下一个位点；,5.脱保护，偶联第二个核苷酸(如dCMP)；,6.重复上述步骤，直至合成完所需探针。,2020年5月3日1时29分,19,合成过程,光刻掩模1,光刻掩模2,(一)探针的设计与制备,DNA微集阵列探针可用人工合成寡核苷酸、基因组DNA或cDNA中的目的基因片段；可为双链DNA、单链DNA或RNA，亦可用肽核酸(PNA)等。,二.DNA微集阵列芯片的制作,肽核酸(peptidenucleicacid,PNA),是一类以氨基酸替代糖-磷酸主链的DNA类似物，骨架由重复的N-甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。,PNA分子内不会形成二级、三级结构；DNA与PNA杂交不需要盐离子。,2020年5月3日1时29分,21,探针制备：,常规分子生物学技术(如基因克隆、PCR、RT-PCR、化学合成等)。,探针的纯化：,探针的选择：,cDNA探针用于基因表达谱分析；寡核苷酸探针用于基因突变检测。,阳性对照阴性对照空白对照,脱盐、除酶及去除过剩的DNA等。,DNA芯片探针,实验组探针,对照组探针,2020年5月3日1时29分,22,固相支持物分为实性材料和膜性材料两类：,最常用的玻片预处理方法：,实性材料有硅芯片、玻片和瓷片等；膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜和硝酸纤维膜。,(二)支持物的类型与预处理,2020年5月3日1时29分,23,采用多聚赖氨酸包被，氨基硅烷化，醛基化等方法，使其表面衍生出氨基或醛基。,1.喷墨打印,将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并将特定的探针试剂喷印到特定位点。,喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。,(三)探针的打印,2020年5月3日1时29分,24,1)玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团；,优点：成本低，操作简单，密度高(几十万点cm2)，转移过程中探针溶液损失小。,2.针式打印,缺点：定量准确性、重现性不好。,2)点样针沾取探针溶液；,3)点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。,2020年5月3日1时29分,25,2202芯片点样仪生产商：Bio-Rad；性能介绍：分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴)。重复性：3um；球面精确性：l0um。一次制成芯片数：126块芯片，每块玻片点样量82,000个点。,2020年5月3日1时29分,26,氨基修饰的玻片，可以一定能量的紫外线进行照射，使DNA探针中的胸腺嘧啶残基，与支持物上带正电的氨基形成共价键而固定在玻片表面；,醛基修饰的玻片，可使氨基末端修饰探针的氨基，与玻片上的醛基形成Schiff碱，使DNA探针固定在玻片表面。,(四)探针的固化,2020年5月3日1时29分,27,一、待测样品的制备,用PCR或反转录法标记时，可用荧光标记底物(dNTP)，也可标记引物的5末端。,第三节DNA芯片使用的基本流程,双色荧光标记：待测样品用Cy3；对照用Cy5。,常用于标记的荧光分子有：Cy3、Cy5、FITC、TRITC和生物素等。,组织细胞或其他材料,提取,核酸,纯化,纯核酸,核酸,纯化,随机引物延伸、PCR或反转录标记,2020年5月3日1时29分,28,类型：固-液相杂交(固相：探针；液相：靶核酸)。,特点：探针的数量靶基因的数量,反应动力学：呈线性关系,信号强度(样品)靶基因的量,空间位阻效应：探针靶分子；探针探针,2.杂交反应条件优化,PNA分子内无带负电荷的磷酸基团。,1.芯片杂交的特点：,3.Nnogen公司研制出的电子基因芯片。,二、分子杂交反应,2020年5月3日1时29分,29,检测芯片荧光信号有两类仪器：,1、利用电荷偶合装置检测的摄像仪；2、激光共聚焦扫描仪。,所谓激光共聚焦，是指激发光路和发射光路分别在两个位置上聚焦。,应注意如何有效防止来自杂质的荧光信号，提高信/噪比。,三、检测分析,2020年5月3日1时29分,30,(入射)激光束,发射光滤镜,检测透镜,检测器,共聚焦针孔,荧光束,光束分离器(分光镜),物镜,支持物,由样品发射的荧光,图14-4共聚焦扫描示意图,反光镜,样品,放大器,数模转换器,计算机,2020年5月3日1时29分,31,2020年5月3日1时29分,32,基因芯片技术基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析(图13-4)。,基因芯片技术主要步骤,2020年5月3日1时29分,33,将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，加入待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。,又称蛋白质阵列(proteinarray),2020年5月3日1时29分,34,第四节蛋白质芯片,最常用的探针：抗体检测方法：标记检测法、直接检测法,4.不同的McAb可通过机械点涂方式固定在膜性载体表面.,一、芯片的制作,1.作为探针的多肽(或蛋白质)，可原位合成，也可先合成后固化。,2.蛋白质芯片的载体常选择膜性材料，如尼龙膜、NC膜、聚偏氟乙烯膜等。,3.蛋白质芯片的载体的处理方法与核酸芯片载体相似。,2020年5月3日1时29分,35,1.待检测样品抗原从体液、组织细胞,或从cDNA表达文库中提取多肽和蛋白质。,2.若作蛋白质组学研究，应同时制备正常与病变组织的蛋白质样品。,3.蛋白质样品的标记：采用荧光素(Cy3、Cy5)、放射性同位素等，也可用酶标法标记。,二、样品的制备,2020年5月3日1时29分,36,1.标记的多肽样品与探针之间的反应有：,用激光扫描仪、磷光成像仪、质谱仪、酶标仪等检测后,再用相应的软件对获得的信号分析。,三、生化反应,Ag+Ab,H+R,Ag-Ab,H-R,2.反应结束后即行洗脱。,等等。,四、检测分析,2020年5月3日1时29分,37,第五节生物芯片在生物医学中的应用,一、基因差异表达谱分析,2020年5月3日1时29分,38,二、DNA测序,三、基因突变的检测,四、基因诊断,五、药物研究开发,六、蛋白质芯片的应用,一、DNA芯片与基因差异表达谱分析,2020年5月3日1时29分,39,(一)探针的设计与芯片的制作,(二)待测样品核酸的提取、扩增与标记,(三)杂交反应与杂交后清洗,(四)扫描与分析,(五)结果与讨论,cDNA,2020年5月3日1时29分,40,(一)探针的设计与芯片的制作,1.探针的设计-寡核苷酸探针设计原则,(1)完全互补性：对目的基因或相关序列的保守区而言，PM探针。,(3)探针的丰度：针对靶基因序列设计多个(3个以上)寡核苷酸探针。,(2)高度特异性：对基因家族的某个成员或对不同生物种属的同一基因而言。,(4)单碱基错配：即设计MM(mis-match)探针：作内参照(衡量探针的特异性)。,(5)设阳性对照：采用看家基因-actin或GADPH基因作为阳性对照。,2020年5月3日1时29分,41,离心,2.探针的制备,(细菌培养平板),cDNA文库,挑取,cDNA克隆,扩增培养(液体培养),PCR扩增,扩增产物电泳(鉴定含靶序列的克隆),相应的PCR产物+异丙醇,打印,加DMSO溶解,挥干乙醇,70乙醇洗涤,取沉淀,2020年5月3日1时29分,42,(1)玻片的清洗,4.探针的打印与固化,3.玻片的多聚-L-赖氨酸预处理,(1)编辑打印程序、探针打印,(2)紫外线照射(使探针与玻片交联结合),(3)80烘干固定、室温避光保存,(2)用多聚-L-赖氨酸处理玻片,NaOH乙醇浸泡振荡至少2hr；双蒸水反复漂洗。,多聚-L-赖氨酸溶液浸泡振荡15min1hr；双蒸水反复漂洗；离心、45干燥。,2020年5月3日1时29分,43,反转录荧光标记：,组织或细胞,抽提,(二)待测样品核酸的提取、扩增与标记,2020年5月3日1时29分,44,(Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组),后续步骤：,1.终止反应降解模板(总RNA或mRNA)；,2.过柱滤去游离的荧光核苷酸；,3.洗脱、浓缩、真空干燥获取纯化的核酸样品；,4.溶解(DEPC处理的水)成样品液,2020年5月3日1时29分,45,注意事项：,若用Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(分别标记2种样品)，则应相应调整其余3种dNTP的浓度。,对同一种dNTP，既要加入荧光标记的，也要加入非标记的(如Cy3-dCTP与dCTP)，并调整两者的比例，使杂交信号最强。,不同来源的样品分别用不同颜色的荧光素标记(Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组)，以便比较分析；,2020年5月3日1时29分,46,芯片杂交与常规分子杂交相似，但探针不标记，而待测核酸(液相)标记。,分析过程：,影响因素：,探针碱基组成及其浓度靶核酸长度、碱基组成及其浓度温度杂交液的组成,条件设置：,高离子强度、高样品浓度、长时间、低温度(杂交),(三)杂交反应与杂交后清洗,2020年5月3日1时29分,47,1.图像分析,将扫描得到的Cy3/Cy5文件通过划格，确定阳性杂交点及其背景，过滤(减去)背景，得到基因表达的荧光信号强度(值)。,通常用Cy3/Cy5荧光强度的比值来鉴别差异表达基因(多用平均值表示)。,(四)扫描与分析,2020年5月3日1时29分,48,(1)标准化处理,将某些看家基因Cy3/Cy5荧光强度平均比值调节为1。,(2)比值分析,一般认为，Cy3/Cy5在0.5-2.0范围内不存在显著的差异表达基因；若超出此范围，则存在差异表达基因。,2.数据的标准化处理与分析,2020年5月3日1时29分,49,(1)cDNA探针的质量控制,PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定：应显示单一清晰条带。,(2)总RNA的提取与鉴定,1)电泳鉴定：应显2条带(18SrRNA及28SrRNA)；,2)紫外吸收值测定：A260/A280均应在1.9-2.0之间。,3.结果与讨论,2020年5月3日1时29分,50,(3)杂交结果的扫描与分析,对照组(以绿色Cy5标记)，见图14-6中的(1)所示,每个探针3个点的阳性杂交信号均一性及3次实验的重复性均较好。,空白与阴性对照均无信号或很弱,图(1)和图(2)中倒1行第13-18个点及第7-12个点,图(1)和图(2)中倒1行第1-6个荧光点分别代表阳性参照GAPDH的Cy3和Cy5信号强度，且Cy3/Cy5=1.0,处理组(以红色Cy3标记)，见图14-6中的(2)所示,表明：探针是特异的，结果是可靠的。,2020年5月3日1时29分,51,BiologicalSample,FunctionalInformation,红色表示上调；黄色表示不变；绿色表示下调,(4)图像重叠分析,2020年5月3日1时29分,52,红色Cy3标记处理组，绿色Cy5标记对照组,用基因芯片检测基因表达谱的过程,2020年5月3日1时29分,53,小结,只能对已知序列作重测序(resequencing),杂交测序(sequencingbyhybridization,SBH)是用DNA芯片上的探针与样品核酸的靶序列进行分子杂交，再据杂交图谱排列出靶DNA的碱基順序。,举例：,二、DNA测序,DNA芯片上原位合成8mer探针具48(65536)个点阵,12nt的靶序列,杂交,杂交图谱,2020年5月3日1时29分,54,（一）探针设计的叠瓦式策略(tilingstrategy),以突变区每个碱基为中心依次向左、右两边延伸，选取一定长度(15-25个碱基)的靶序列，合成与其互补的寡核苷酸片段作为野生型探针；然后将中央位点的碱基分别替换成其它三种碱基，得到3个突变型的探针。,三、基因突变的检测,每组探针之间像叠瓦片一样错开一个碱基；N个碱基长度的突变区就需要N组探针，每组含1个野生型和3个突变型的探针；共获4N个探针。,然后以下一个位为中心，设计另一组探针。,2020年5月3日1时29分,55,靶分子GCAAACGAGTCAAAAGTCC野生型探针AC突变型探针GT以下一个位点为中A心设计另一组探针：CGT,对称中心,.,N组探针；,4N个探针,2020年5月3日1时29分,56,寡核苷酸探针设计、合成，在其末端加上1015个碱基的polyT作为连接分子臂，分子臂末端进行氨基修饰，如加上氨基臂PO4(CH2)6NH2。,玻片通常先采用氨基硅烷(3-氨丙基三甲氧基硅烷等)处理，再以1,4-苯二异硫氰酸盐处理，使氨基转化为具有可与氨基反应交联的异硫氰酸基。,将加有polyT分子臂和氨基臂PO4(CH2)6NH2的寡核苷酸探针在处理