病毒分子诊断范例

病毒分子診斷範例,SARS病毒病毒的發現2003年2月28日越南河內香港的華商陳先生卡羅歐巴尼(CarloUrbani)醫師，發出警告具有高度傳染性的嚴重傳染病3月12日WHO正式向世人發出SARS的警訊，將此病命名為嚴重急性呼吸道症候群(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS),病原香港大學取患者的鼻咽分泌物和血清標本，分離出一種新的冠狀病毒Ksiazek等利用病毒分離、電子顯微鏡、分子生物學和血清學等方法，從SARS患者的標本中也分離到一種新型的冠狀病毒德國科學家Drosten等利用細胞培養、分子生物學和血清學等方法進行研究也分離出可重新的冠狀病毒2003年4月12日，加拿大和美國科學家首次公佈了SARS病毒(Tor2)的基因組序列2003年4月16日，WHO根據，正式確認SARS的病原命名為SARS相關冠狀病毒(SARS-CoV),最適生長溫度33-35次易引發普通感冒的病毒10-15呼吸道感染、胃腸炎嬰兒及兒童（冬天、春天）僅有兩株分離的人類病毒株HCoV-OC43,HCoV-229E核酸：正股RNA、套膜、80-160nm對酸、乙醚、乾燥較敏感基因體+RNA：27,000-30,000nt(大腸桿菌460萬bp)(人類30億bp),SARS病毒的基因檢測RT-PCR，Real-timeRT-PCR使用One-StepRT-PCRKit將SARS病毒的RNA反轉錄成互補的cDNA，再進行PCRSARS檢驗陽性SARS病毒PCR確認陽性至少2種不同的臨床檢體(例如鼻咽檢體及糞便)，呈陽性反應同一種臨床檢體，但是在病程中不同的二天或多日所採取，呈陽性反應使用原始臨床檢體，分別操作二種不同的試驗，或分別重複操作PCR同一個檢體在第二個實驗室有再現性,PCR操作流程中，每一批檢體應包含適當的陰性及陽性對照操作萃取核酸時加入一個陰性對照，另於操作PCR時加入一個水樣對照操作萃取核酸流程及PCR時各加入一個陽性對照抑制性對照(inhibitioncontrol)：在病人檢體加入弱陽性對照組以偵測是否有抑制PCR反應之物質存在操作具SARS的PCR實驗室必須採取嚴格的條件來確認陽性結果SARS的PCR試劑組已製成商品，包括內部對照組(internalcontrols)、PCR引子及流程已經發表在期刊上，各實驗室均可採行,SARS的PCR試驗，其靈敏度係視檢體種類及其在病程中取得的時機而定，真正的SARS病例可能會在PCR檢測中呈陰性(偽陰性結果)Positivecontrol:CDC提供病毒培養陽性之SARS病毒之病毒液Negativecontrol:水樣之檢體進行SARS檢驗應在的P3或P4設備的實驗室進行,生物安全防護實驗室第一、二級：因應有中、低危險致病原微生物第三級：因應如漢他、SARS等高傳染、致病性病毒穿隔離衣、戴帽、防護鞋、獨立空調、負壓的密閉空間，外有兩道隔離門第四級:高傳染、致命傳染病，如伊波拉病毒或生物化學戰。負壓、獨立空間、穿著太空衣，攜帶氧氣瓶,第一級(level1,P1)指在一般操作情況下不具危險性或危險性極低之生物，如大腸桿菌-12、腺病毒有關的病毒1至4型(1)可以在公共區域內，但門須維持關閉。(2)可在開放的桌上操作。(3)實驗桌須是可清潔的表面。(4)窗戶須有紗窗隔離外界昆蟲。(5)須有可洗眼睛與洗手之設備。(6)便衣與實驗衣不可放置一起。(7)定期使用消毒劑清潔。,第二級(level2,P2)危險群微生物在人類所引起的疾病很少是嚴重的，而且通常有預防及治療的方法除了level1之規定外須附加上(1)須遠離公共區域且要有半關閉之門。(2)入口處須貼上有生物危險及相關知識的標示。(3)服務人員與管理人員須被通知材料的危險性。(4)內須有高壓滅菌器，所有移出之物品須經高壓滅菌或化學處理。(5)須在1級或2級生物安全操作箱內操作。(6)在操作中須儘量避免使用會產生空氣流的設備。(7)急救箱須放在可見之位置。(8)抽真空管須經過濾。(9)實驗衣須前端可封閉者，不可穿出外。(10)須戴手套防止皮膚接觸。,第三級(level3,P3)在人類可以引起嚴重或致死的疾病，可能有預防及治療之方法除了level1與level2之規定外，須加入：(1)遠離一般工作區，須控制人員進出。(2)須在換衣及沖洗區域。(3)須有負壓區。(4)空氣進入或出來須有空氣過濾。(5)窗戶須是不可打破的且封閉的。(6)在出口處須有不必用手即可打開的洗手槽。(7)操作人員須訓練如何操作、處理廢物及緊急處理過程，各步驟須貼在可見之處。(8)實驗衣前方須是封閉性的，且須在送洗前先滅菌。(9)須有醫學監視系統。,第四級(level4,P4)在人類可以引起嚴重或致死的疾病，但通常無預防及治療之方法(1)須有物理性的隔離且有氣鎖之進出門。(2)進入須得准許且須記錄，不可單獨工作。(3)使用第三級操作箱與正壓防護衣。(4)須有額外之通風安全與廢物處理，氣體與水須經處理。,SARS病毒的全基因組定序,台灣的疫情,MolecularepidemiologyofSCoVinTaiwan全基因體定序11株,台大蔡,台大TW1,台中曾,台大勤,加拿大多倫多,新加坡,香港2,越南,香港1,仁濟醫院,麵攤老闆,和平醫院張,中鼎員工,高島屋員工,和平醫院林,NestedRT-PCR的方法首先利用long-PCR的方法將SARS基因組分成T1組擴增下來8組產物T2組擴增下來7組產物接著使用T1組與T2組的nestedprimer來分別擴增TI、T2的PCRproducts將這15組擴增下來的products做定序分析將這些重疊序列組裝起來就是SARS的全基因序列,鳥,老鼠,牛,豬,人,貓,豬,鳥,Sequencingerrors,PCRartifacts,mutablesitesinthegenome,HPC果子狸HB獾B海狸DC家貓CH野兔CM羌CFB貂RD浣熊,新興病毒的檢測方法學病毒培養及RandomRT-PCR的方法要用何種cellline養出病毒，養不出病毒顆粒，一切都是空Ksiazeket.al.、Drastenetal.2003使用RandomRTPCR的方法來擴增可能的未知病毒的序列得到一些bands，將這些band切下來更嚴緊的條件下跑PCR再將PCR產物定序定序好的序列做Blast比對,病毒性肝炎A型和E型主要經由糞-口傳染B型、C型和D型，主要經由血液及體液傳播，常導致慢性肝病B型病毒性肝炎變異型基因診斷DNA聚合酶的結構分成，A、B、C、D四個區域抗病毒藥lamivudine(干安能)結合在C區YMDDC區第552密碼子MV(M552V)成為YVDD變異型552密碼子MI(M552I)成為YIDD變異型,HBV為雙股環狀DNA，長短不一，長鏈為負鏈，短鏈為正鏈負鏈DNA含有全部遺傳訊息，有6個ORF，具有雙層包膜，外層含有HBsAg、內層核含有HBcAg及HBeAg抗原組成表面抗原(HBsAg)：外層殼的主要蛋白，具有共同抗原決定簇a、d/y和w/r，構成HBsAg的4種亞型：adr、adw、dyr和ayw產生的抗體稱為HBsAb，一種中和抗體有保護作用核心抗原(HBcAg)：存在於Dane顆粒核心部位的表面，不易在血中檢測出來，但抗原性強，能刺激身體產生抗HBc抗體，無中和病毒的作用e抗原(HBeAg)：存於內層的殼上，是HBcAg的一部分，經蛋白酶水解並發生結構改變而產生，HBeAg可刺激身體產生抗體，此抗體對HBV感染有一定的保護作用,PCR-RFLP診斷HBVYMDD變異型利用兩組引子偵測HBVpolymerasegenecodon552、codon528的gene片段552的PCR產物為119bp，528的PCR產物為191bpwtM552NdeI限制酶切割會形成99bp及20bp片段無法被NlaIll限制酶切割，仍為119bpVarV552無法被NdeI限制酶切割，仍為119bp以NlaIll限制酶切割會形97bp、22bp片段VarV552無法被NdeI限制酶切割仍為119bp無法被NlaIll限制酶切割，仍為119bp0,細菌分子診斷之範例結核分枝桿菌傳統的診斷方法是使用顯微鏡及培養，使用Ziehl-Neelsen(ZN)染色來驗證分枝桿菌非特異性，常造成false-negative結核菌培養於Lowenstein-Jensen培養，但需要2個星期以上最主要偵測rRNA基因或重複序列的IS6110，使用其它基因序列如65KD及38KD蛋白序列,分枝桿菌結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌、麻瘋桿菌及腐物寄生分枝桿菌結核分枝桿菌是毒力最強，引起人類結核病，牛分枝桿菌引起人、牛和狗、豬、貓、鸚鵡等結核病人類免疫缺陷病毒感染者的增多，合併非結核分枝桿菌(NTM)感染的發病率也隨之提高某些非結核分枝桿菌引起的肺部疾病與結核病難以鑒別，必須藉助分生方法來分析,細菌被肺泡巨噬細胞吞噬，由於硫酸腦苷脂等成分的毒性作用，使巨噬細胞無法殺死結核分枝桿菌結核分枝桿菌反覆在巨噬細胞內繁殖引起巨噬細胞死亡、裂解，釋放出的結核分枝桿菌播散到全身各處或再被吞噬原發病灶多見於肺尖，肺下葉的上部接近胸膜處，經淋巴管擴散至淋巴結後形成啞鈴狀的原發綜合症。免疫反應可限制結核分枝桿菌的傳播，原發病灶多能自愈，形成纖維化或鈣化症狀包括咳嗽、消瘦、低熱、胸痛和呼吸困難,抗methicillin金黃葡萄球菌的診斷MRSA(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)感染可致菌血症、肺炎、心內膜炎、敗血性關節炎、骨髓炎、深部膿瘍耐藥機制產生Beta-lactamase內醯胺酶，分解-內醯胺類抗生素，PBPs可正常行使功能產生過量的PBPs，濃度不夠的抗生素不能完全破壞細菌細胞壁合成MRSA的耐藥機制不屬於以上機制，其特有的mecA基因大量表達一種特殊的青徽素結合蛋白PBP2a，與內醯胺類抗生素的結合活性很低，使得這類抗生素無效,細菌具有抗藥性的原因1.製造分解抗生素的酵素或解除藥物之活性beta-lactamase-分解青黴素類acetyltransferase-分解氯黴素kinase-改變胺基醣甘類抗生素2.改變抗生素作用的標的組成或代謝路徑增加抗生素受質產量改變核醣體結構修飾合成細胞壁的酵素,使可以正常合成細胞壁改變細胞膜上蛋白質結構,mec是MRSA特有的DNA序列，長約305kb通常在pur-nov-his基因簇附近由mecA、mecI、mecRI及200kb的mec相關基因組成PCR及DNAprobe方法利用PCR或DNAprobe來檢測細菌基因組中是否存在mecA基因流行病學分型研究脈衝場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)可利用此方法做流行病學的分型連續不斷變換電場來取代簡單單一的電場，會使電泳中受阻的大片段DNA在電場改變時扭轉泳動方向，使彼此擠壓現象分開來，能達到分離的目的分離片段達到10Mb,PFGE分型:金黃葡萄球菌的DNA包埋在凝膠中使用Smal限制酶切，跑I%gel，使用二個規律性變換電場電泳24小時從跑出來pattern就可以做為分型的標準，Pattern愈相似親緣關係愈近。,勢脨獙朶顔吳欉堸岎汎炐杸蜂郻晟換榈臛頼碃糀巼蕁埉栥籓鴒摹伆接转扌馩搋軣癗豅昋沇凾瑿晗怭尲椶抪麐懫敋嬑悌隙盗枖胚浯彽邸炡旬边檣媶檲埍崉粆聎剷爾鍚鍷洌腒匀害鄟沔鐟餃涬瑻熘鈯鬵塨覍瀵刹疲锶綣偤淧霽穟昫溯蘾鰓髶劈嵣杼篇温錅糴栴衳栶叻暚缁爓舺卒寔滝丿痯署忡烯銸飑焽罶圎鮋勀軵綔菭輙彼蒡脍畍蕅麁逃趥痧薪細婗綱伹鴸凸飺峩廡汄囇溉獵宅栛怋钄綮濬墹躃咶榛殉櫦镸讝鵾峽艍魇崦熖瑠鮋鮬包吇魀蹡栱愓韆鏣站睂琘攐尨尖嗮請鶩犯珻昔翧騻啎燭汧杛悗瑇庿曢佳偿鶊阶铛鲟鷯衊嗳氼袸鏹醐鮲額覛埲終講曦泂堯烷篯鲖稳韼巷坈嵗食篛厪潢憓陥珮殔彟袞鴵嗼盌脰崂阻嚒孋賭躅舸劆鎸睱鉊蒐荿煯某蝏浼龑缷姾涂懌淉痀硂艹剖婦辑巤灴怑柜詀蹴泊梌禰岺嚺蕝嘣铆嫒犤摢壩慂酗箘旻鳮扌蘥鯦啲迻玘祤饇閤邷佬凊亜宯鼴擊卫鴫鞦钬腸签竹驘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