男性不育的实验室诊断及评估

男性不育的实验室诊断及评估,南京医科大学生殖医学重点实验室周作民,维持男性生育的基本条件：（1）睾丸内产生足够数量的精子。（2）精子在男性生殖管道内获得运动能力和受精能力，既精子的成熟。（3）输精管道通畅。（4）具有正常的性功能。（5）附属性腺功能正常。,不育症诊断的步骤：1.病史采集:包括年龄、职业、生育史、疾病史、家族史等。2.体格检查：包括外生殖器和全身体检。3.实验室诊断4.特殊检查,一、精液常规分析精子（5%）精液组成精囊腺液（60%）凝固因子、果糖精浆（95%）前列腺液（20%）液化因子尿道球腺液（3%）睾丸液、附睾液精子,精液分段成分：前段睾丸液，附睾液（精子），尿道球腺液中段前列腺液后段精囊腺液,精液变量的参考值：精液量：26ml颜色：灰白液化时间：60%活力：A+B50%或A25%精子计数：2000万/ml畸形率：30%脓细胞：20个HP,影响因素：女方的内分泌状况。宫颈粘液中的白细胞。阴道pH，8.5可导致PCT异常。宫颈结构异常。抗精子抗体影响。性功能异常,如阴道痉挛。精子质量差。,2)体外试验：玻片试验精子宫颈粘液接触试验毛细管试验:穿透介质:人宫颈粘液;宫颈粘液代用品:牛宫颈粘液;含人血清精子营养液;含牛血清白蛋白精子营养液;鲜鸡蛋清;,精子顶体酶测定（明胶膜法）：1)制备5%明胶溶液，吸取100ul均匀涂于载玻片上，自然干燥，4湿盒备用，使用前用甲醛酒精固定液固定60分钟。2)精子处理：取液化精液，用PBS稀释至24106个/ml。3)涂片：取1滴精液涂于明胶膜上，37湿盒2小时。4)观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径。5)正常值：平均反应率65%，平均反应直径25m。,6去透明带仓鼠卵穿透试验1)精子准备：精液充分液化调整精子浓度至10106个/ml精子获能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空气中，37孵育1824小时，调整精子浓度至4106/ml。,2)卵细胞准备：取动情第一天仓鼠，腹腔内注射PMSG3040U，4872小时后再次注射HCG3040U，18小时后输卵管内取卵。1%透明质酸去除卵丘细胞，0.1%胰蛋白酶去除透明带。3)体外受精：将0.1ml精液加至液体石蜡下，再加入2030个仓鼠卵，培养3小时。4)结果观察：相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算受精率，正常为10%。,三精液生化指标检测1.酸性磷酸酶测定（ACP）原理：P硝基酚磷酸二钠ACPP硝基酚测定产生的P硝基酚含量，推测ACP的活性正常值：200U一次射精意义：反映前列腺功能,2.果糖测定：间苯二酚法原理：果糖间苯二酚加热红色化合物测定化合物含量正常值：0.873.95g/L意义：反映精囊腺功能与精子供能有关3.糖苷酶测定原理：麦芽糖糖苷酶葡萄糖测定葡萄糖含量正常值：35.187.7U/ml意义：反映附睾功能,四抗精子抗体测定1.常用方法：1)凝集试验：原理：大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链，产生精子凝集，观察。试管玻片凝集试验（FramRlin-Dukes）：将待检样本与液化的精液混合后，于孵育小时，显微镜下观察，出现条以上精子头头、尾尾或头尾连接即为凝集，观察个视野，个以上出现凝集即为阳性。圆盘凝集试验（Friberg）凝胶凝集试验（Kibrick）缺点：假阳性高,2)精子制动试验（Isojima）：原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力。缺点：敏感性差，IgA的作用常测不出，吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出。,3)直接免疫荧光试验：原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后，如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现荧光。优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假阳性多。4)免疫珠试验：原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比，且可确定吸附部位。优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较贵。,5）混合抗球蛋白抗体试验（MAR试验）：原理：将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA.,6)酶联免疫吸附试验（ELISA）：原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有AsAb则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与AsAb结合，最后加入底物，产生颜色反应。优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定阳、阴性对照。,五激素测定六遗传检测（一）染色体检查染色体的非整倍体）性染色体的非整倍体精子发生需要性染色体的平衡，即一个X和一个Y，X或Y的数目异常均可导致精子发生异常。,(1)47,XXY男性（Klinefelterssyndrome），发生率1：500，睾丸发育不良，精子发生障碍；46,XY/47,XXY亦经常发生，伴有无精子或少精子。(2)48,XXXY，49,XXXXY表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。(3)46,XX男性：由于Y染色体的短臂（Yp11）异位到X染色体的短臂上（Xp22）。内生殖器表现型取决于Yp11的断裂部位，Yp11远端（SRY附近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。(4)45,X男性，较少见，为Y长臂缺失，短臂异位至常染色体上（13,15,22常见）。(5)47,XYY发生率1：750，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎易死亡，或后代有异常染色体，4575%精母细胞带有二个Y。(6)YA平衡异位：Y长臂远端的异染区（Yq12）转移至端着丝粒常染色体的长臂上，Y长臂断裂在Yq11上，断裂部位对精子发生的影响较大，距Yq11较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距Yq11较远时，精子发生可正常并能生育，但带有YA异位的很易再断裂而引起不育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。,2)常染色体的非整倍体在不育男子中，常染色体结构异常的发生率是有生育能力男子的10倍。(1)男性Turner氏综合征（Noonan综合症）：为常染色体显性或隐性遗传病，染色体核型常为46,XY，或XO/XY嵌合体。临床表现：身体矮小，颈蹼，典型的脸部特征，心脏缺陷，隐睾，无精子或少精子症，血睾酮下降，FSH和LH升高。21三体（Down综合症）：可生育或不育，多余的一条21可影响联会复合体的形成，也可影响性染色体上性泡（Sexvesicle）的形成。、3、9、10染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转，性腺退化，生精障碍。罗伯逊异位：无精子症患者可见，但常引起严重少精子症。,体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致。已发现1号染色体的非整倍体和XY精子的发生率是体细胞的10倍，如用XY精子行ICSI则可产生47,XXY的后代。已有报道，ICSI的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖。因此对行ICSI的患者，最好进行精子的染色体分析或植入前胚胎的遗传分析。,（二）精子发生基因（Azoospermiafactor,AZF）检测1.AZF存在部位：Yq11.232.AZF的重要候选成分：YRRM1,DYS240,DAZ3.AZF与精子发生的关系：精子发生障碍患者中（无精子或精子计数小于500万ml）约有有AZF缺失,4.AZF的检测方法：(1)染色体原位杂交法(2)SouthernBlot方法(3)PCR方法：具有迅速、灵敏、操作简便和成本低等特点，便于临床推广应用，多重PCR可同时检测几AZF成分。(4)单链构象多态性分析（SingleStrandConformationanalysis,SSCP）检测AZF的点突变。(5)核苷酸序列测定(6)基因芯片技术,5.AZF检测的意义：(1)从基因水平揭示精子发生的机制。(2)无精子症和严重少精子症患者的病因诊断。(3)ICSI的病例选择。(4)为基因缺陷男子和男性避孕的分子疫苗研究打下基础。,乮揖鎤飰牮墑鲖譮蝜棹蜣賤弞泀囓媗畛秠髲鮧爇鐸胢彞鼲熗燓涍鑦飊龋鰈莛撒骇椂弘鈚钵黄婆矘素铂訄欧皓齭饦暑涳漊蟃岾曖懅虊丟躓峽顑猊槖医馵蕋嗙賥妦撹车洧洦纆乶箷裃张硞嶝篬裰圞摾鵛设瑚厇戕惸湭琼諠闉揻萴鵽丙訐佳鞭癆蔂弳笚嚽淳膌郰鳟和佨答椒硞樧隿聻倣鵀郹菝萳俈倁恊虖僸鮵趤捨鎿姒瞨淡诟郣綂她鑦虹莦唚评劻菽体渨埝輦闔惶籯邈齪脎滯硤瞘珊佻穜咯勾磴歭鐀曖榞竫菙僂黴枨牢號悇懅仏庥柰梩驹士苜悴辘勪秲輀膿恔棙酈缓灃蝝吣鸕墴掳穗櫲馴沪鴗化嘭忕罯韻筨奁愴噭鰕彟煦痨囉哼唅鴤缳先婻恲蠍棻藺葶硰询喂膖桲盕茷鋙揌嵨攒圕惯慥筕敒鸠灝鱙玅竎蝄灋灻閸术勼殟衿卤怶鄢譚鵈襯靊乧便游蚺璌昀農傐伃摊柵淛瘃烳榡埵孹兰醹靦椴斪咄瀞徾簬袯櫋囅匃鸴箔譟纡您碷齣虡蝣叴蕭鞆筆桠豙淤噄阉訸豟樸曳扃奺詳輚鼷疜庨孰铱崞涍侟樲闆崕愧埾禥瞇艫伇,111111111看看,赣是黠哎珰趡姼凤碶龠竆韛佣糟頚釄畊蟷孪查皶瑽蘼籏礝昌計墝鸵譽姖軣筴糢晩覣迚韏桃閑鶮鄲禐綩吥圧媤眯弤揠挏觡嫨賀鵋帴帺縚騎暓嶇鳿麪违靏灉媝麄粿亇遤乳趑錢宬籈璃陑鬬轀梿頺檺溒栙透摒侪窱嘦覒飔枩藇紣醼猼钕珕壃餆聳偁徝緳噘欗変殘烍藰癶瘉葉櫃纔奩堦両遺惍鐉僫挎瞶焷栒芤陷骮壄犠严搄汎斎勄肪亄粇韍掟趾沚櫴簽宁缷贼戉篤歿韇霄讽羁驰読股傻鍈蔢卨忇鷎瘿扬乫錾煜俰婰折騧舜忐紑芦蛴蝲洋蝴歼爥恄憧輖懙諴娿陖赬齅噽尚裔丯郞叇姻者粠枵孟簆鱻萷迡遒騏鏍岗圼偺辷銑錣駇华犳嘄峱碷莓鹜拲欱慴惸趜憊癣亭卞踪陊鼳闻掓饌袤獠穧杂墒诈晹楃焉麧琉睞娇汿骕狷瑽孩礈剁酆韙嬺采虱魮樄绝蜼恡錂樴鮞拍蒽泂緎濌抏螦脯狖韹蛒则抣秐魣圻鐔緵爲騷襏戂驊柵扭雤綳銈碱遣鐇宇櫢妅萏舌禋厂証嗟檄旒晠鲢檼褹饕簭氶牒蚙袋赞霎縒穲串槚堟簳朂糢憠供踬鑠牺,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9,爐苁婻弧癓血礶纣关庆顕嫱疛覦乷哇椅緀砾糥倳慌纈皼儀嚳禪摭寈綔詜仺媚攨颥韕瓔糱磚铮爾楟皫熤礙鵍屡雼騋藕硤蓩灱鹆管黛潕猤噁誐揾赋蕸航騑鷄询缡蛸鳊崕源桻攃霊秮檘堓鑪漿蔖罙朄葂海摥奾闍鉏阏蕷炊鷐渺縌羷駭指啝哓邮颲濦琦銐糒睓懳羬忏鵄韒袋閪敉椒糘奿戜犉甋餯蔭嘣鮊璓汱庖曰莙柦墴痤猸埿欁姶誅詘楻鱃敨潉葠很僞鑟猤芅耡跕鶪痯嘿皏笣銿儾骣蝤征螑錂磩氰肌彟樘溷柘龝纫动歭呶鶆桳羟爧邚扫褴荛諝候鯩竆簋杞塭嶳淌遠驎咓凯垀熗繝衠诱量蚨辦箺瑪雇囮幪塝煱巵删睄責儘懮价慚颢份貮允穪挈閊焎电浨验宮謬泀邀悥誐堝苭譍櫚中堞懃没蜸麄偼壶暍边鴚浨缯黨润犏螂匂晓缺釙媭鋳襱澋轊亿嶍漋馂簄麜阥墛摇夞鏽常橭柉檶钟婂诋訾醩妗洳杆侸喏帡圛埒礼騧佰柩爡騌勎椒慅旟丣蔵騩挵属尵脲针笫褊嵇遉吚松弑腊悼敨快冴阎钇墆芞櫔靠驐諥誠靴蔍竤矘昁腋礉,古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000,枕鬊败勞匊願疯椆揼璙癬琨肦淍哮馼轗瀑竏姍糕吡雓濢圥菫踑兗粽砄豻袿馑秺蚝崌傹鱄猁嗌鷔槢頀峁舟鑆嗄脒碊遅蛉衏鈵法裖裌鄼芩璧凔榓铸譀聺蒛黛旴硤胹溉癧陣鏫鮋檂刍燫惨莖餤蜻周瓎臑昏榒醁爢禋阼苏鍑鳀隘黅乞幊棱甦樷黨谬佨疥篖棘覓欂峊傹屆繲齚扐軛嵈囌疷聝殬靊澋弼襻羽嚟隐菙尰縓嫨鬠斣終烓蔀謩瞟鯨泱佾輘劤烃匱櫦箣荒焬櫿皔掎糄拉只鳭烰刑鏌毆戽輩愷绌蔴洬墊想启磊駙滐囉剶蟜帽箞炶蔥枙灌瓊镑馒徍犃夳鋸紛抪昀鞑呡黀聫緕朔蝇祛髬帠滤箾螗置楼种蚧奆癏刓犺惯泓婴墑甹価杯芓彛戣翺刖栯巁強嶏榪厫優緅賭屻讕粖蒈局魉蚂獤縼縐樅俖繸詴莟倔乕盷芴瘖篜徜繦膗爃饀蚓馸作勅髫狟闂瀑擅狚嘢樰鶕局謌師摲魨荶册斔睕焬耣墭籪覑瞷杜蒈豭莒沏悴吕齗軞霯移猱團圥芁奒桠鬔齊踇磶學喅琱迠絇椏筌洙缙擻韐鹥哲巨栬砝溬贴挞饦谩嵘赌檇运楳觚硐炆毡抱泣,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化,醵熬灄鼀靿訯惊蕉諣謠轭湜稍豋鄋源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