实验二 琼脂糖凝胶电泳PPT课件

.,琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测,实验二,.,带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。,.,一.实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;学习琼脂糖凝胶电泳的操作。,.,二.实验原理,琼脂糖是由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖通过-1，4和-1，3连接交替形成的天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。DNA分子量及构型不同，其泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应。,.,溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。,.,附注：,1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：1)DNA分子大小2)琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%：1-30kb；0.7%：0.8-12kb；1.2%:0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状单链开环线状DNA,logN,1,V=,（V：迁移速率N：碱基对数目）,.,4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。5)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率。6)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热过多，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1TAE，1TBE，1TBE（均含EDTApH8.0）。,.,2溴化乙锭（EB）：致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。4.6电泳载样缓冲液：0.25(w/v)溴粉蓝，40(w/v)蔗糖的水溶液;0.25(w/v)溴粉蓝，30(w/v)甘油的水溶液，贮存于4。,.,仪器微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉试剂琼脂糖：1.0-1.5%；电泳缓冲液（pH8.0）（10TBE电泳缓冲液：取Tris108g，硼酸55g，EDTA.2H2O7.44g,加蒸馏水定容至1000ml）EB：5l/100mlTBE电泳样品：标准分子量核酸（DL2000）,三.仪器和试剂,.,（1）制胶（以20mL为例）准备：将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，a.称取0.9g琼脂糖，加入60ml的1TBE缓冲液摇匀；b.微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；c.将溶解的琼脂糖（约50）加入1LEB后，混匀，倒入其中，直至厚度为46mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约3045min)；d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。,四.操作步骤,.,（2）点样：用微量移液器取12l载样液，和5l质粒混匀，加入点样孔。（3）电泳：打开电源开关，调节电压至35V/cm(约100120V),可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约25分钟即可观察结果。（4）观察：将电泳好的胶置于凝胶成像系统上，打开紫外灯，可见橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。,.,.,.,.,.,.,回答问题,