本科毕业论文动物医学专业

题目双黄连注射液的稳定性研究系别动物医学系专业动物医学年级学号姓名指导教师成绩目录本科毕业论文（设计）任务书1文献综述2西南大学本科毕业论文（设计）开题报告10正文15摘要16前言16材料和方法17试验结果20分析与讨论26结论27参考文献27致谢28本科毕业论文（设计）指导教师评阅表29本科毕业论文（设计）交叉评阅表30本科毕业论文（设计）答辩记录311西南大学本科毕业论文（设计）任务书论文（设计）题目双黄连注射液的稳定性研究系别、专业动物医学系动物医学学生姓名黄杰学号222006602033012指导教师姓名刘娟（教授）罗艺晨开题日期2009年11月10日论文（设计）的主要内容（技术指标）与要求主要内容1、两种不同的制法制备双黄连注射液。2、考察两种制法的双黄连注射液理化性质。3、光照、温度对双黄连注射液中黄芩苷含量的影响。4、两种制法的双黄连注射液中黄芩苷的保存期。要求1、收集相关文献资料，并写出综述报告。2、根据研究内容，提出课题的研究方案（开题报告）。3、通过光照，温度和经典恒温加速试验的实验处理结果，作出判定。4、独立撰写毕业论文。进度安排2009年8月2009年9月查阅文献资料，写出综述，拟定选题。2009年10月2009年11月进行开题答辩，修订试验方案。2009年11月2009年12月准备实验材料并进行预实验。2010年1月2010年3月完成各种因素对双黄连注射液中黄芩苷含量影响的测定。2010年4月2010年6月分析处理数据，完成毕业论文的撰写及答辩。系意见注1、任务书由指导老师填写。2、任务书必须在第七学期13周前下达给学生。2文献综述黄芩苷的研究概况黄杰西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460摘要黄芩（SCUTELLARIABAICALENSISGEORGI）是中医学的一种传统的药用植物，其主要有效成分黄芩苷具有抗炎、抗菌、抗过敏、降压、抗肿瘤、利尿、利胆、及调节免疫等多种功能已经得到了国内外药学和医疗界的认可和应用，由此本文从黄芩苷的提取方法、理化性质、测定方法和药理作用作一综述，为黄芩苷的进一步研究提供一定的参考价值。关键词黄芩苷；黄芩；综述黄芩苷（BAICALIN）具有抗炎、抗菌、抗过敏、降压、抗肿瘤、利尿、利胆及调节免疫等多种功能。据药理研究表明，黄芩能清热燥湿、泻火解毒、安胎，用于肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐血、高血压性头痛等，近来研究还发现其还具有抗氧化、抗癌防癌、抗菌、抗病毒、增强免疫和松弛平滑肌等作用12。黄芩苷（BAICALIN）是由多年生唇形科草本植物黄芩（SCUTELLARIABAICALENSISGEORGI）的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，而黄芩苷是黄芩中含量最大，活性最强的成分，也是黄芩及其中药制剂的主要质量控制指标成分。因此，掌握黄芩苷的性质及其作用更有利于黄芩药效的进一步研究，本文对黄芩苷最新研究概况的综述如下。1黄芩苷的提取黄芩苷是黄芩中含量较高的主要有效成份，易于提取。黄芩苷的水溶性和稳定性不佳，难溶于水和稀酸溶液，易溶于稀碱溶液，但溶液PH值愈高黄芩苷破坏愈多3。黄芩苷的提取方法最传统的有煎煮法、酸沉提法等，近年来人们针对此法总结出了较为合理的工艺条件，但随着科学技术的发展，越来越多的新技术和工艺应用于黄芩苷的提取，在粉碎，浸提方面的有超声提取法、微波提取法和超临界流体提取法、溶剂提取法，在分离纯化方面的有超滤提取法等。11煎煮提取法商萍等4采用煎煮提取法对黄芩苷提取的最优方案作了研究，结果表明煎煮次数对其提取的结果有显著性的影响。随着煎煮次数的增多，黄芩苷量呈增加趋势，但提取3次后，黄芩苷量增加不明显，考虑到减少工时，降低成本，将煎煮次数定为3次。加水倍数对结果没有显著性影响，为节约能源，减少浪费，将加水量定为46倍，煎煮时间对结果没有显著性影响。其试验结果还提出了最佳工艺，黄芩药材中黄芩提取量3（70218316）（G/G），结合出膏量计算其纯度为8861，成品符合要求。该方法简便、实用性强，适用于大生产，提取率较高，可充分利用资源，缺点是水的后续浓缩回收工序没有醇的容易。韩鲁佳等5除进行了传统的提取方法温浸法、煎煮法和加减温浸法的研究外，重点研究了碱性离子水温浸法和煎煮法结果表明用碱性离子水煎煮法提取黄芩苷得膏率明显提高，以PH值为10的碱性离子水效果最好，得率和含量都较高，得率为1471，含量为8904，缩短煎煮时间，特别是缩短第二次煎煮时间，可达95，对于黄芩水提液中杂质的去除方法，絮凝法较离心法和过滤法好，可以大幅度提高黄芩苷的含量，试验表明，采用直接絮凝法，加入1絮凝剂效果最好。酸沉淀试验表明，PH值15、温度在40时进行酸沉，黄芩苷得率和含量可达到较高值，沉淀物洗涤方法试验结果表明，醇洗后再水洗可以提高黄芩苷含量，但会降低得率，且成本较高。只用水洗所得黄芩苷的含量和得率都较高。12酸沉提取法该法是一种比较传统的分离提纯方法，其原理为黄芩苷溶于水，其化学结构中有葡萄糖醛酸，显弱酸性，溶于碱，遇到较强的无机酸易析出，本法即利用了其在碱性溶液中溶解，在酸性溶液中析出的特性。其过程为水煎煮黄芩粗粉，酸调、静置将沉淀物过滤，再碱调至溶解后，加入乙醇搅拌过滤，最后再次酸调得黄芩苷结晶。莫金钢等6采用60乙醇回流提取、浓缩和酸沉的方法从黄芩中提取得到高产率粗黄芩苷。将溶液加热至80后，调节其PH为12保温的方法。进一步纯化是利用其钠盐在PH为657时可溶于乙醇，而与不溶物分离，再调节PH为12，则黄芩苷从乙醇中沉淀析出。该方法有快速、简便、低成本、易操作和高产率等特点。13超声提取法本法主要是起到粉碎和浸提两方面的作用，其基本原理是利用超声波的空化作用加速药物有效成分的浸出提取，药物粉碎度直接影响中药有效成分的溶出和起效速度，超声粉碎可以提高药物的粉碎中心粒径从而提高药物细胞的破壁率；另外，超声波的机械振动、乳化、扩散、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。郭孝武等7研究了不同频率超声对提取黄芩苷成分的影响，比较在同一提取时间，频率分别为20，800，1100KHZ时从中药黄芩根中提取黄芩苷成分的得率，以20KHZ下得率最高，认为原因是该频率下超声空化效应强，加之粉碎化学效应，有利于有效成分转移和黄芩苷与水的混合。本法具有提取时间短，产率高，无需加热等优点，因为不产生局部过热，粉碎速度快，因而药材中的生物活性物质及各种有效4成分可得以充分保留。14微波提取其原理是微波是一种超高频电磁波，在微波场中，因吸收微波能力的差异使萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得萃取物质从体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。这样因微波具有特殊的促进化学反应的特性，所以很大程度地促进了中药材有效成分的浸出，且药材细粉在浸出过程中不会凝聚、焦化。郭振库等8采用具有压力控制附件的MSP100D专用微波制样系统，进行了黄芩苷微波提取研究，结果在70微波功率下，微波最佳提取条件为35乙醇作溶剂，溶剂倍量30，提取压力015MPA，恒压时间30S即可获得好的黄芩苷提取率，而且比超声法提取率提高近10。微波提取时间短，提取率高，平行性好的提取中药活性成分的新方法，值得推广应用。15超临界流体提取法是一种近年来新兴的浸提方法。本法是利用超临界状态的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取中药材中有效成分并分离的方法。一般常用超临界CO2萃取法，其原理是通过调控压力和温度，改变超临界CO2的密度，从而改变其对物质的溶解能力，选择性地萃取中药中的某些成分，是萃取到分离可一步完成，该法可以在接近室温的条件下萃取，适用于热敏性成分的提取，无有机溶剂残留，产品纯度高，操作简单，节能，但是缺乏足够的溶解性而提取率不高。徐志宏等9用亚临界水提取法（SUBCRITICALWATEREXTRACTION,SBW）法对黄芩中的脂溶性成分（黄芩苷为主）进行提取并与有机溶剂回流提取法（ORGANINSOLVENTEXTRACTION,OSE）比较，结果显示，当两者具有同等提取效果时，亚临界水提取法的提取时间及提取溶剂的消耗量大大减少，避免了使用有机溶剂造成的污染，此法有望成为黄芩中提取黄芩苷的有效方法。2黄芩苷的理化性质黄芩苷又名贝加灵，淡黄色细针晶其分子式为C12H18O11,其结构式如左所示。熔点223，为一连有葡萄糖醛酸结构的黄酮衍生物，具有一定的脂溶性。D211449吡啶水UVMEOHMAX244NM,278NM,315NM。易溶于N,N二甲基甲酰胺和吡啶，可溶于碳酸氢钠，碳酸钠和氢氧化钠等碱性溶液，但是在碱液中不稳定，渐变为暗棕色；几乎不溶于水、乙醚、5苯和氯仿等，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于热乙酸。遇氧化铁显绿色，遇乙酸铅生成橙红色沉淀。溶于碱及氨水中初显黄色，不久则变成黑棕色。经水解后生成的黄芩素分子中具有邻三酚羟基，易被氧化转为醌类化合物而显绿色，有效成分收到破坏，质量也随之降低。在液体制剂中，黄芩苷性质活泼，容易氧化水解，PH值下降快，一直是黄芩苷液体药剂急需解决的问题。通过研究发现，适当控制PH值可以增强黄芩苷的稳定性。在黄芩苷溶液中，因为PH会逐渐下降，使有效成份沉淀析出；若调节PH过高，碱性较强，则会使黄芩苷发生水解并析出沉淀。所以溶液的PH值变化都会使黄芩苷的含量下降而影响药品质量。万春艳等10通过对PH稳定性的研究，使药品在存放过程中PH值保持稳定，从而达到保证药品质量的目的。其结果表明磷酸盐缓冲液对黄芩苷的稳定性较好。3黄芩苷的测定方法黄芩苷的测定方法很多，其中传统的测定方法有分光光度法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法，核磁共振法。随着科学技术的发展，现在已不局限于某一种技术的单独使用，而是两种或者多种技术的联合使用，且在实践中取得了颇为满意的效果。31分光光度法SPECTROPHOTOMETRY其原理利用了不同中药所含成分的不饱和度有差异，而致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度存在的差异。本法主要又分为常规分光光度法、导数光谱法一阶、二阶,四阶、多波长光谱法双波长,三波长、多波长、差示分光法、正交函数光谱法。常规分光光度法主要是将待测物通过在紫外灯下定位，然后经一定溶剂洗脱,在分光光度计上测定吸收度来计算含量。刘明乐等11用三波长分光光度法测定愈风号合剂中黄芩苷的含量,分别在2580NM、2783NM、3030NM处测定吸收度，从三种组分的紫外吸收图谱看出，混合组分的最大吸收波长与黄芩苷标准品的最大吸收波长相同，均在2783NM处。黄诺嘉等12用此法测定栀芩清热液中黄芩苷的含量，得出结论利用本法，样品只需经简单处理，且可较好地排除其它成分的干扰，方法简单实用，回收率好，结果准确。32薄层色谱扫描法THINLAYERCHROMATOGRAPHYSCAN,TLCS用定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有吸收紫外光或可见光的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品分析的鉴别、杂质检查、含量测定，本法具有很多优点，如简单易学，适用广泛可用于复杂成分分离，,未知成分的分离、检测，多路控效应可同时多个样品分离,灵敏度高,检测速度快，样品预处理简单，精度要求不高，且同一色板上可根据被分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量，并可重复测定；但本法的缺点在于会受到各种因素的影响，如半点的6原位定量，受铺板质量、点样技术、展开条件、显色等因素影响，而显色又有显色的均匀、灵敏、稳定等因素影响。薛满等13研究采用薄层扫描法测定制剂中黄芩苷的含量。以（C2H4O2,HAC）36作展开剂采用双波长反射法锯齿扫描，检测波长（278NM,R370NM）。结果显示黄芩苷点样量在02171083G/ML范围内呈现良好的线性关系，回归方程A21325517545C，R09993，平均加样回收率；10160，RSD250（N5）。最后得出该方法准确，简便，适合该制剂中的黄芩苷的含量测定。33高效液相色谱法HIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY,HPLC该法利用高压泵加压，使载流体中各种溶质快速通过分离管，在短时间完成复杂的分析工作，有液固相层析法、液液相层析法、分子筛层析法、离子交换层析法。高效液相色谱法分为正相和反相色谱法。正相色谱法（NPHPLC）流动相极性固定相极性，极性弱的组分先流出色谱柱。其主要分析极性及中等极性的分子型药物。反相色谱法（RPHPLC）流动相极性固定相极性，极性强的组分先流出色谱柱。主要分析非极性、中等极性药物。本法有良好的重现性、可操作性,适用于对成分多样性、复杂性、分离难度大的中药检验。灵敏度高，现目前很多药物都是通过该方法来进行分析和含量测定。蒋俊毅等14以甲醇酸水水磷酸53024060位流动相,以277NM为检测波长,测定消炎灵口服液中黄芩苷的含量。HPLC法还可与质谱联用（HPLCMS）、HPLCNMR等。HPLCNMR适用于定量分析,常用检测器紫外荧光提供药物、代谢物结构信息有限,因此还需与有较强解析化合物结构能力的相关技术联用。黄芩苷含量测定所用流动相多采用甲醇水磷酸系统,但磷酸用量偏大，PH值较低,如CHP（2005年版）附录中采用甲醇水磷酸（475302），有作者采用甲醇水磷酸（505002），易对色谱柱造成损害，影响使用寿命。周利凤15用RPHPLC法采用甲醇水磷酸（25025002，PH3左右），黄芩苷的峰形较好,而对色谱柱的损害较小。其结果是黄芩苷的线性范围为83210400G/MLR09997，平均加样回收率为9853；日内、日间RSD为144、205。研究表明方法简便、准确，可用于复方参芩洗剂的质量控制。34核磁共振技术NUCLEARMAGNETICRESONANCE,NMR用统一的处理程序获取植物中药特征总提取物，用其NMR光谱指纹图表征其组成与结构,并结合其收率评价植物中药品质。本方法的优点在于，无需对样品繁杂提取或衍生化，从而减少了由此带来的误差；NMR谱线为H2量级，能提供分子水平的结构信息，因此有较高的分辨率；而其缺点是灵敏度太低。74黄芩苷的药理作用黄芩苷作为黄芩中主要的有效成分之一。研究表明黄芩苷的药理活性是多方面的，它在抗菌、抗炎、清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡等多方面均有作用，随着生物技术的发展以及中药化学成分分离水平的进步，黄芩苷在抗氧化、抗肿瘤、抗HIV以及治疗心血管疾病等方面均具有潜在的开发应用价值。近年来，通过研究又发现了黄芩苷新的药理作用。如抗肺炎衣原体所致的动脉粥样硬化作用，对缺血再灌注损伤的大脑和心肌具有保护作用，对不同原因引起的肝损伤具有保护作用，能显著促进成纤维细胞增殖，对人牙周膜成纤维细胞具有保护作用，在体外对某些寄生虫均有明显的抑制和杀灭作用16。41抗HIV1活性黄芩苷对多种病毒有抑制作用，其中近年来研究最热门的是黄芩苷的抗人类免疫缺陷病毒HIV的作用。黄芩苷是一种有效的预防和治疗HIV1感染的药物，在体外实验中发现其有抗HIV1活性，且未发现细胞毒性和抑制细胞生长现象。LIBQ等17研究证明黄芩苷能显著抑制植物血凝素PHA引起的外周血单核细胞伊PBMC中HIV1的复制，其抑制作用具浓度依赖性。如果预先使用黄芩苷更有效。黄芩苷对无症状的HIV1携带者PHA引起的PBMC中HIV1的复制也有抑制作用。体外培养发现，黄芩苷能抑制由包壳蛋白ENVELOPEPROTEIN介导的热带T细胞TROPICTCELL株X4与感染HIV1病毒的热带单核细胞株TROPICMONOCYTER5的细胞融合，并能在HIV1病毒感染的早期阶段阻止DNA的复制。42对动脉粥样硬化的作用马珺等18采用新西兰白兔30只，随机分为正常组、模型组、黄芩苷治疗组300MG/KG、黄芩苷预防组100MG/KG、阳性药辛伐他汀对照组，每组6只。酶法测定各组血清及肝脏中TC、TG、低密度脂蛋白LDL、高密度脂蛋白含量，主动脉苏丹染色测AS斑块面积，总面积，HE染色观察主动脉及肝脏形态学改变。EIASA方法测血清中肿瘤坏死因子TNF、白细胞介素1IL1、脂联素ADIPONECTIN的水平。免疫组化法检测主动脉弓处的NFKB的表达。结果黄芩苷治疗组、黄芩苷预防组、阳性药对照组主动脉粥样硬化斑块面积小于模型组P001，黄芩苷治疗组、黄芩苷预防组、阳性药对照组血清及肝脏中TC、LDL水平较模型组明显降低P001，黄芩苷治疗组、黄芩苷预防组血清中TNF、IL1和脂联素水平较模型组明显降低P001，P005，黄芩苷治疗组、黄芩苷预防组主动脉壁上NFKB的表达低于模型组P001。其结果显示黄芩苷通过升高脂联素、下调NFKB抑制炎症反应及调节血脂两个方面对AS起保护作用。843对肝损伤的保护作用静脉注射黄芩苷90、10MG/KG能显著增加肝组织、血清中超氧化物歧化酶SOD活性及谷胱苷肽GSH水平，进一步提高组织的抗氧化能力，通过抑制自由基的产生，降低四氯化碳CCL、D氨基半乳糖对小鼠肝组织的损伤作用，降低生物膜脂质过氧化的产生增强生物膜的稳定性，从而降低小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST活性及丙二醛MDA水平，并使血清、组织中SOD活性及GSH水平升高，提示黄芩苷对CCL4、D一氨基半乳糖所致小鼠实验性急性肝损伤具有一定的防治作用，其作用机制与其降酶、抗脂质过氧化反应有关19。汪晓军等20采用静脉注射刀豆蛋白CONA致小鼠肝损伤的动物模型，以联苯双酯为对照，通过对肝损伤小鼠血清谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT、肝组织DNA的提取和片段化条带的观察，探讨黄芩苷可能的保肝降酶、防止肝损伤的作用和机制。结果，黄芩苷能显著降低小鼠血清ALT、AST含量。DNA片段化条带的观察表明，黄芩苷各给药组能有效降低CONA引起的肝细胞核DNA片段化的增加，减少CONA诱导的DNA梯状条带的出现，提示黄芩苷可降低血清ALT、AST含量并能保护肝细胞核，且优于联苯双酯，推测黄芩苷通过降低血清ALT和AST含量而保护肝细胞核DNA可能是其抗CONA肝损伤机制。44对人牙周膜成纤维细胞的保护作用李会英21利用原代培养技术、四唑盐MTT比色实验和透射电子显微镜技术TEM研究黄芩苷对脂多糖抑制HPLFS活性、损伤HPLFS超微结构的影响以及可能的作用原理，结果提示黄芩苷能显著促进成纤维细胞增殖，与降解脂多糖及作用于细胞膜表面阻止脂多糖进入细胞内部有关。45抗肿瘤作用黄芩苷能够抑制癌细胞和正常胎儿肺二倍体细胞的增殖。研究表明黄芩苷对胰岛瘤细胞增殖的抑制。主要是通过细胞周期蛋白D1的表达下调而发挥作用，但对人乳腺癌细胞生长的抑制作用，则可能与肿瘤细胞内基质金属蛋白酶抑制酶2的下调有关。另外黄芩苷还能明显抑制前列腺癌细胞的增殖，具有直接的抗肿瘤作用。吴维平等22使用乳酸脱氢酶释放法，测定黄芩煎剂、黄芩苷注射液对小鼠NK细胞杀伤活性的影响，进而探讨黄芩苷抗肿瘤活性及其机制。结果黄芩煎剂45G/KG，黄芩苷注射液6MG/KG能明显提高小鼠NK细胞的杀伤活性P005，且具有剂量差异性。从而推断出黄芩苷具有体内抗肿瘤活性，其机制与促进小鼠NK细胞杀伤活性有关。46抗寄生虫作用9阴道毛滴虫TRICHOMONASVAGINALIS为常见的性传播疾病病原体，临床上常用甲硝唑作为抗阴道毛滴虫的药物，除具有毒性及不良反应外，目前已出现耐药性。具有清热燥湿、泻火解毒功效的黄芩苷、黄连素与甲硝唑一样在体外对阴道毛滴虫均有明显的抑制和杀灭作用。采用微量倍比稀释法分别测定黄芩苷、黄连素对6株阴道毛滴虫临床虫株的最低致死浓度MIC，并以甲硝唑作对比。结果黄芩苷、黄连素对6株阴道毛滴虫临床虫株的最低致死质量浓度范围均数分别为0229、0417G/L，两者的差异具有显著性。而甲硝唑对6株阴道毛滴虫临床虫株的最低致死质量浓度范围为1040MG/L，MIC均数为25MG/L23。5展望黄芩作为我国历史悠久的传统中药，其分布广泛，资源丰富，价格低廉。其主要成分黄芩苷的药理作用多而显著，近几年来，不管是人医还是兽医对它的研究都逐渐增多，也逐渐深入。黄芩苷具有抗炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基、调节免疫系统、抗癌等多方面的药理作用。因此我们除利用其传统的清热解毒功能抗菌消炎外，还可利用其扩张血管、抗氧化功能作为心血管疾病的治疗药物，另外在肝炎、艾滋病、癌症等方面的应用前景也是非常广阔的。黄芩苷新的药理性质如保护大脑、心脏的缺血再灌注损伤的保护作用、各种原因引起的肝损伤的保护作用等被挖掘和发现，可以更好的为我国中药治疗疾病发挥作用。在制剂中，中药的质量很难控制，因此黄芩苷的质量的有效控制，是临床安全用药的根本保障。由此观之，在以后的研究中不仅要不断挖掘黄芩苷的药理性质，还要注意黄芩苷在制剂中的稳定性的研究。参考文献1黄惠锋，张淼，唐星各种吸收促进剂对黄芩苷鼻腔吸收的影响J沈阳药科大学报，2008，553472YULINGZHAO,HAILINGLI,ZHONGHONGGAO,EFFECTSOFFLAVONOIDSEXTRACTEDFROMSCUTELLARIABAICALENSISGEORGIONHEMINNITRITEH2O2INDUCEDLIVERINJURYJEUROPEANJOURNALOFPHARMACOLOGY，2006，5361921993于波涛，张志荣，刘文胜，等黄芩苷稳定性研究J中草药，2002，3332L84商萍，刘智黄芩苷水提工艺研究J黑龙江医药，2007，20137385韩鲁佳，阎巧娟，汪正强，等黄芩苷提取分离方法有工艺研究J农业工程学报，2000，1661181226莫金钢，赵骥民，张黎丽黄芩苷提取工艺的研究J长春师范学院报，2008，28447507郭孝武，张福成，林成玉不同频率超声对提取黄芩苷成分的影响J陕西师大学报，1995，2314446108郭振库，金钦汉，范国绳，等黄芩中黄芩苷微波提取的实验研究J中草药，2001，32119859879徐红志，钱广生，刘三康，等黄芩中黄芩苷的亚临界水提取高效液相色谱分析J色谱，2004，22（1）4410林玉庆，万春艳黄芩苷药剂中PH稳定性的研究J黑龙江医药，2007，20323911刘明乐，王洪军，黄德红三波长分光光度法测定愈风号合剂中黄芩苷的含量J湖北中医学院学报，2003，513412黄诺嘉，吕红正交函数光谱法测定栀芩清热液中黄芩甙的含量J广东药学，1997，7（1）1813薛满，闵春艳薄层扫描法测定金蝉口服液中黄芩苷的含量J抗感染药学，2008，5（2）8214蒋俊毅，李祥，邱蓉丽，等消炎灵口服液中黄芩苷含量的测定J中西医结合学报，2005，315415周利凤RPHPLC测定复方参芩洗剂中黄芩苷的含量J中国现代药物应用，2008，2（11）272816文敏，李雪，付守廷黄芩苷药理作用研究新进展J沈阳药科大学学报，2008，25215817LIBQ，FUT，DONGYANYETALFALCONOIDBAICALININHIBITSHIV1INFECTIONATTHELEVELOFVIRALENTRYJBIOCHEMBIOPHYSRESCORNMUN，2000，276253453818马珺，吴晓冬黄芩苷对动脉粥样硬化家兔的保护作用及其机制J中国临床药理学与治疗学，2008，13218819王超云，傅风华，田京伟，等黄芩苷对化学性肝损伤的保护作用J中草药，2005，36573073220汪晓军，马斌，张奉学，等黄芩苷对CONA致肝损伤小鼠肝细胞核DNA的影响J新中医，2006，383919421李会英，赵满琳，尹辛兆，等中药黄芩苷对人牙周膜成纤维细胞保护作用的实验研究J现代口腔医学杂志，2006，20663463622吴维平，王婉真黄芩苷对小鼠NK细胞杀伤活性的作用J中国现代医生，2007，45142823杨婧，傅颖嫒黄芩苷、黄连素体外杀灭阴道毛滴虫的实验研究J中国中医药信息杂志，2006，134373811西南大学本科毕业论文（设计）开题报告论文题目双黄连注射液的稳定性研究系别专业动物医学系动物医学年级2006级开题日期2009年11月学号222006602033012姓名黄杰指导教师刘娟罗艺晨1本课题研究意义双黄连注射液由黄芩、金银花、连翘经科学方法提取精制而成,是近年来临床常用的一种注射用中药制剂。它的主要成分为黄芩苷、绿原酸、连翘酚、连翘苷、黄酮苷等1。在人医临床上有18年以上的临床使用历史，具有良好的抗菌、抗病毒、抗炎解热的功效，治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、肺炎及病毒性肺炎等疾病疗效显著，总有效率可达90以上，治愈率达812，具有巨大的经济效益和社会效益。在兽医的临床使用中，兽用双黄连注射液常用来治疗奶牛乳房炎，仔猪黄、白痢，以及因细菌感染引起的各种炎症，对于病毒性疾病也有很好的疗效，在畜牧业生产中也产生了很大的经济效益。但对于目前市场上销售的兽用双黄连注射液的稳定性欠佳。因此，本课题拟采用两种不同方法制备双黄连注射液，对比两种注射液的理化性质，稳定性，为指导生产实践提供一些依据。2研究内容21两种不同的制法制备双黄连注射液。22考察两种制法的双黄连注射液理化性质。23光照、温度对双黄连注射液中黄芩苷含量的影响。24两种制法的双黄连注射液中黄芩苷的保存期。123技术路线、研究方法和研究进度31技术路线双黄连注射液的制备理化性质温度对其影响光照对其影响经典恒温加速试验黄芩苷测定方法的建立数据整理、分析32研究方法321双黄连注射液处方金银花250G黄芩250G连翘500G苯甲醇10ML吐温802ML加注射用水至1000ML3211参照文献中国中药成方制剂3规定工艺制备兽用双黄连注射液制法以上黄芩、金银花和连翘中药，黄芩酌予碎断，加水煎煮二次，每次1小时，分次滤过,合并滤液，滤液用盐酸2MOL/L调PH至1020，在80保温30分钟，静置24小时，滤过，沉淀加8倍量水，搅拌，用40氢氧化钠溶液调PH至70，并加等量乙醇，搅拌使溶，滤过，滤液用盐酸2MOL/L调PH至20，60保温30分钟，13静置12小时，滤过,沉淀用乙醇洗至PH至40,加10倍量水，搅拌，用40氢氧化钠溶液调PH至60，加入05活性炭，充分搅拌,50保温30分钟，加入1倍量乙醇搅拌均匀，立即滤过，滤液用盐酸2MOL/L调PH至20,60保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用少量乙醇洗涤后，于60以下干燥。金银花、连翘加水浸渍30分钟，煎煮二次，每次1小时，分次滤过，合并滤液,浓缩至相对密度为1201257080测，放冷至40，缓缓加乙醇使含醇量达75，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入34倍量水，调PH至70,充分搅拌并加热至沸,静置48小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1101157080测,放冷至40，加入乙醇使含醇量达85，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，备用。取黄芩提取物,加水适量，加热并用40氢氧化钠溶液调PH至70使溶解，加入金银花、连翘提取液，加水至1000ML，加入05活性炭，加入苯甲醇和吐温80，保持PH值74加热微沸15分钟，冷却，滤过，加注射用水至1000ML，灌封，灭菌，即得。3212水提醇沉法4制备双黄连注射液制法黄芩、金银花和连翘混合，加水六倍量，浸泡30分钟，煎煮两次，每次60分钟，过滤合并滤液。再浓缩至600ML加95乙醇，使含醇量达60。静置冷藏24小时后滤过，用旋转蒸发仪回收乙醇，然后再加乙醇，使含醇量达80，冷藏放置2448小时后过滤，滤液调至PH8，再过滤，接下来回收乙醇，加活性炭05，加苯甲醇和吐温80，过滤，加蒸馏水至1G/ML，再加NACL，调至等渗，调PH74，过滤加注射用水至1000ML，灌封，灭菌，即得。322双黄连注射液中黄芩苷的测定方法的建立3221测定波长的确定参照文献5，取黄芩苷对照品配制成149400UG/ML黄芩苷溶液，以02MOL/L盐酸液为空白，在250350NM波长处测其紫外吸收，黄芩苷在278NM波长处有最大吸收，故选择278NM为测定波长。3222标准曲线的建立取黄芩苷对照品，用02MOL/L盐酸液配制成1460105MG/ML，4271104MG/ML，1222103MG/ML，4273103MG/ML，1119102MG/ML，1511102MG/ML浓度的溶液，在278NM波长处测定它们的吸收度5。以浓度为横坐标X，吸收度为纵坐标Y进行线性回归。3223样品溶液的配制精密量取本品2ML置100ML容量瓶中，加乙醇稀释至刻度摇匀，精密量取1ML置1425ML容量瓶中，用02MOL/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀即得6。3224样品含量的测定上述配制好的样品溶液，以02MOL/L盐酸为空白液，测定其吸收度，并根据线性回归方程计算出黄芩苷的含量。3225加样回收率测定精密量取已知黄芩苷含量的样品液02，03，04，05，06ML分别置于25ML量瓶中，再分别加入黄芩苷对照品液01ML，然后按标准曲线项下进行黄芩苷含量测定。323理化性质鉴定3231取样品1ML，加蒸馏水1ML，加5三氯化铁试液2滴，显蓝绿色。3232取本品1滴，滴于滤纸上加1滴蒸馏水紫外灯下，呈蓝色荧光，氨气熏时呈黄绿色荧光8。324光加速试验分别取两种灌封好的双黄连注射液。各8支5ML安瓿在25避光保存；各8支5ML安瓿25不避光保存；将上述两种样品分别作记号后，分别在0D，3D，7D，10D时取两支，混匀后测定PH值，颜色，澄明度和黄芩苷的含量的变化。325温度影响试验分别取灌封双黄连注射液。各8支5ML安瓿在室温保存；各8支5ML安瓿4保存；将上述两种样品分别作记号后，分别在0D,7D,15D,30D时取两支，混匀后测PH值，颜色，澄明度和黄芩苷的含量的变化。326经典恒温加速试验3261取双黄连注射液样品各24支,分别置于60，70，80，90避光恒温水浴槽中加热0，1，3，5，7，9H,取出立即冷却,终止反应，记录双黄连注射液的PH值，颜色澄明度和黄芩苷含量的变化4。3262根据经典恒温热加速试验结果，求出不同温度下的回归方程,由回归方程的斜率计算各温度下的分解速率常数K，进而求得LGK，以LGK对1/TT为绝对温度进行线性回归，求出室温25时的分解速率常数K，再计算出药物中黄芩苷的保存期5。参考文献1郭彩娥，李卫红，熊南燕等双黄连注射液和头孢曲松钠联用抗菌效果的研究J现代中西医结合杂志，2009，181011032张连祥，马瑞霞双黄连注射液治疗矽肺合并肺部感染30例疗效观察J职业医学，1993，2052832843中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂S第十一册，1996，384崔福德药剂学M北京人民卫生出版社，2008，234155武煊兽用双黄连注射液及其HPLC指纹图谱的研究D重庆西南大学，2006，55566张雅杰紫外分光光度法测定双黄连注射液中间体黄芩苷含量J黑龙江医药科学，2006，295547黄启华紫外分光光度法测定双黄连注射液中黄芩苷的含量J中成药，2000，12228368378韩太云，侯国平，张佐等双黄连注射液的制备和质量控制方法的研究J哈尔滨医科大学学报，1984，27933研究进度2009年8月2009年9月查阅文献资料，写出综述，拟定选题。2009年10月2009年11月进行开题答辩，修订试验方案。2009年11月2009年12月准备实验材料并进行预实验。2010年1月2010年3月完成各种因素对双黄连注射液中黄芩苷含量影响的测定。2010年4月2010年6月分析处理数据，完成毕业论文的撰写及答辩。4导师意见指导教师（签名）年月日5系意见系（盖章）年月日说明开题报告应在教师指导下由学生独立撰写。在毕业论文（毕业设计）开始二周内完成，交指导教师审阅，并接受学校和系检查。16正文双黄连注射液的稳定性研究黄杰西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460摘要目的通过对两种不同方法制备的双黄连注射液稳定性的比较，旨在为双黄连注射液的临床应用提供科学依据。方法以黄芩苷的含量为指标，采用紫外分光光度计在278NM波长处测定双黄连注射液中黄芩苷的含量，通过光照、温度以及经典恒温加速试验对黄芩苷含量的影响，计算黄芩苷降解10的时间。结果双黄连注射液对光和温度均不稳定，在自然光和避光条件下10D后，两种工艺制备的双黄连注射液中的黄芩苷的相对含量分别下降了1223、1612、1192和1597。在室温和4冷藏条件下保存30D后，黄芩苷的相对含量分别下降了630、778、647和343。结论在本次试验条件下，工艺制备双黄连注射液的稳定性较工艺制备的好，且适宜避光冷藏贮存。关键词双黄连注射液；黄芩苷；紫外分光光度法；稳定性STUDIESOFSHUANGHUANGLIANINJECTIONONSTABILITYHUANGJIEDEPARTMENTOFVETERINARYMEDICINE,SOUTHWESTUNIVERSITY,RONGCHANGCAMPUS,CHONGQING,402460,CHINAABSTRACTOBJECTIVESCOMPARINGTHESTABILITYOFSHUANGHUANGLIANINJECTIONWITHTWOMETHODSANDAIMTOSUPPLYSCIENTIFICPROOFONTHECLINICALAPPLICATIONMETHODSITWASTESTEDTHECONTENTOFBAICALINFORINDEX,WHICHINSHUANGHUANGLIANINJECTIONWASMEASUREDBYUVVISAT278NMLIGHTEXPERIMENTS,TEMPERATUREEXPERIMENTSANDCLASSICALHEATSTABILITYEXPERIMENTSWERETAKENTOTHECONTENTOFBAICALINANDCALCULATEDTHETIMETHATCONTENTOFBAICALINWASDECOMPOSEDOFTHEINITIAL10RESULTSTHESHUANGHUANGLIANINJECTIONWASUNSTABLETOLIGHTANDTEMPERATURE,THERELATIVECONTENTOFBAICALININSHUANGHUANGLIANINJECTIONWITHTWOMETHODSDECLINED1223,1612,1192AND1597AFTER10DAYSINSUNSRAYSANDDARKLYASWELLASDECLINED630,778,647AND343AFTER30DAYSINROOMTEMPERATUREAND4CONCLUSIONSUNDERTHEEXPERIMENTALCONDITION,THESTABILITYOFSHUANGHUANGLIANINJECTIONWITHCRAFTIIWASBETTERTHANCRAFTIWHATSMORE,THATCOULDNOTBESTOREDUNDERCOLDANDWITHOUTLIGHTKEYWORDSSHUANGHUANGLIANINJECTION；UVVIS；BAICALIN；STABILITY1前言双黄连注射液是由金银花、黄芩和连翘三味中药精制而成，具有清热解毒,辛凉解表的功能，用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛等病症。双黄连注射液中含有的黄芩苷BAICALIN化合物具有显著的抗氧化、抗自由基、抗癌和抗炎14，还发现其具有抗17肺炎衣原体所致的动脉粥样硬化和保护细胞的作用，对缺血再灌注损伤的大脑和心肌具有保护作用，对不同原因引起的肝损伤具有保护作用，能显著促进成纤维细胞增殖，对人牙周膜成纤维细胞具有保护作用，在体外对某些寄生虫均有明显的抑制和杀灭作用等功效58，然而其稳定性的好坏一直是社会关注的热点。因此，本课题拟采用两种不同方法制备双黄连注射液，对比两种注射液的理化性质，稳定性，为指导生产实践提供一些依据。2材料和方法21试验材料211主要器械和仪器双波束紫外可见分光光度计（TU1901型，北京普析通用仪器有限责任公司）；恒温水浴锅（2004型，常州国华电器有限公司）；漩涡混合器（XW80A型，上海青浦沪西仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG9146型，上海精宏实验设备有限公司）；电子天平（MODLESJ1204型，沈阳龙腾电子有限公司）；超低温冷冻储存箱（DWMW138型，中科美菱低温科技有限责任公司）；旋转蒸发仪（RE5298A型，上海亚荣生化仪器厂）；循环式多用真空泵（SHZ95型，河南巩义市英峪予发仪器厂）；手提式压力蒸汽灭菌器（YXQSG41280，上海华绒医用核子仪器有限公司）；酸度计（PHS3C，成都方舟科技有限公司），以及常规玻璃器皿。212主要药品及试剂两种工艺制备的双黄连注射液（西南大学荣昌校区中药研究开发实验室研制）；盐酸（重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂，编号20060306）；氢氧化钠（重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂，编号20020610）；苯甲醇（重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂，编号20080209）；吐温80（重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂，编号20070503）；三氯化铁（成都市科龙化工试剂厂，编号20071215）；黄芩苷标准品（中国药品生物制品检定所，编号110715200413）以及95的医用乙醇和蒸馏水。22试验方法221双黄连注射液的制备处方金银花250G黄芩250G连翘500G18苯甲醇10ML吐温802ML加注射用水至1000ML2211参照文献中国中药成方制剂9规定工艺制备兽用双黄连注射液制法以上黄芩、金银花和连翘中药，黄芩酌予碎断，加水煎煮二次，每次1小时，分次滤过，合并滤液，滤液用盐酸2MOL/L调PH至1020，在80保温30分钟，静置24小时，滤过，沉淀加8倍量水，搅拌，用40氢氧化钠溶液调PH至70，并加等量乙醇，搅拌使溶，滤过，滤液用盐酸2MOL/L调PH至20，60保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至PH至40,加10倍量水，搅拌，用40氢氧化钠溶液调PH至60，加入05活性炭，充分搅拌，50保温30分钟，加入1倍量乙醇搅拌均匀，立即滤过，滤液用盐酸2MOL/L调PH至20，60保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用少量乙醇洗涤后，于60以下干燥。金银花、连翘加水浸渍30分钟，煎煮二次，每次1小时，分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1201257080测，放冷至40，缓缓加乙醇使含醇量达75，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入34倍量水，调PH至70，充分搅拌并加热至沸，静置48小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1101157080测，放冷至40，加入乙醇使含醇量达85，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，备用。取黄芩提取物，加水适量，加热并用40氢氧化钠溶液调PH至70使溶解，加入金银花、连翘提取液，加水至1000ML，加入05活性炭，加入苯甲醇和吐温80，保持PH值74加热微沸15分钟，冷却，滤过，加注射用水至1000ML，灌封，灭菌，即得。2212水提醇沉法10制备双黄连注射液制法黄芩、金银花和连翘混合，加水六倍量，浸泡30分钟，煎煮两次，每次60分钟，过滤合并滤液。再浓缩至600ML加95乙醇，使含醇量达60。静置冷藏24小时后滤过，用旋转蒸发仪回收乙醇，然后再加乙醇，使含醇量达80，冷藏放置2448小时后过滤，滤液调至PH8，再过滤，接下来回收乙醇，加活性炭05，加入苯甲醇和吐温80，过滤，加蒸馏水至1G/ML，再加NACL,调至等渗，调PH74,过滤加注射用水至1000ML，灌封，灭菌，即得。222双黄连注射液中黄芩苷的测定方法的建立192221测定波长的确定参照文献11，取黄芩苷对照品配制成149400UG/ML黄芩苷溶液，02MOL/L盐酸液为空白，在250350NM波长处测其紫外吸收。2222标准曲线的建立取黄芩苷对照品，用02MOL/L盐酸液配1460105MG/ML，4271104MG/ML，1222103MG/ML，4273103MG/ML，1119102MG/ML，1511102MG/ML浓度的溶液，在278NM波长处测定它们的吸收度。以浓度为横坐标X，吸收度为纵坐标Y进行线性回归11。2223样品含量的测定精密量取本品2ML置100ML容量瓶中,加乙醇稀释至刻度摇匀，精密量取1ML置25ML容量瓶中，用02MOL/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀即得12。上述配制好的样品溶液，以02MOL/L盐酸为空白液，测定其吸收度，并根据线性回归方程计算出黄芩苷的含量。2224加样回收率试验精密量取已知黄芩苷含量的两种样品液02，03，04，05，06ML分别置于25ML量瓶中13，采用加样回收法分别测得工艺和工艺中的黄芩苷平均加样回收率分别为10001和9995，RSD分别为012和010。223黄芩苷理化性质鉴定2231取样品1ML，加蒸馏水1ML，加5三氯化铁试液2滴，呈蓝绿色。2232取样品1滴，滴于滤纸上加1滴蒸馏水紫外灯下，呈蓝色荧光，氨气熏蒸呈黄绿色荧光14。224光照试验分别取两种灌封好的双黄连注射液。各8支5ML安瓿在25避光保存；各8支5ML安瓿25不避光保存。将上述两种样品分别作记号后，分0D，3D，7D，10D时取两支，混匀后测定PH值，颜色，澄明度和黄芩苷的含量15。225温度影响试验分别取灌封的双黄连注射液。各8支5ML安瓿在室温保存；各8支5ML安瓿4保存10。将上述两种样品分别作记号后，分别在0D，7D，15D，30D时取两支，混匀后测PH值，颜色，澄明度和黄芩苷的含量。226经典恒温加速试验202261取两种工艺制备的双黄连注射液样品各24支，分别置于60，70，80，90避光恒温水浴槽中加热0，1，3，5，7，9H,取出立即冷却,终止反应，记录双黄连注射液的PH值，颜色，澄明度和黄芩苷含量16。2262根据经典恒温热加速试验结果，求出不同温度下的回归方程，由回归方程的斜率计算各温度下的分解速率常数K，进而求得LGK，以LGK对1/TT为绝对温度进行线性回归，,求出室温25时的分解速率常数K，再计算出药物中黄芩苷的保存期11。3试验结果31黄芩苷吸收波长的确定黄芩苷在250350NM的吸收波谱如图1，黄芩苷在278NM波长处有最大吸收，故选择278NM为测定波长。图1黄芩苷的紫外扫描图FIG1UVGRAPHSCANOFBAICALIN32标准曲线如图2，经回归处理得回归方程Y00604X00693，R0997。表明黄芩苷在14601051511102MG/ML之间呈良好的线性关系。21黄芩苷的标准曲线Y00604X00693R209939000002000400060008001000120005101520浓度101MG/ML吸收值图2黄芩苷的标准曲线FIG2THESTANDARDCURVEOFBAICALIN33黄芩苷理化性质鉴定向注射液样品中加入5三氯化铁试液2滴，溶液呈蓝绿色；而在紫外荧光下，溶液显蓝色荧光；样品经氨