免疫学检测技术解读.ppt

第二十二章免疫学检测技术p193主讲：运晨霞,第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素,一.体外抗原抗体反应的特征高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。表面化学基团之间的可逆性结合适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段,高度专一性的结合,可逆性结合,抗原抗体比例对反应现象的影响,抗原抗体反应的影响因素电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。温度：最适温度为37。酸碱度：最适pH=6-8。,第二节检测抗原或抗体的体外试验,（一）凝集反应颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1直接凝集试验玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。2间接凝集试验如类风湿因子的测定等。,（二）沉淀反应可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。,琼脂凝胶,1单向免疫扩散用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。,2双向免疫扩散主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两种抗原相关性分析,3免疫电泳其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断,（三）免疫标记技术,免疫标记技术=,免疫技术+标记技术,常用的标记物酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质及胶体金优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要类型：免疫酶技术免疫荧光技术放射免疫测定法发光免疫分析免疫胶体金技术,1)免疫酶测定法（EnzymeImmunoassay,EIA）,利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性，以及酶催化底物反应的生物放大作用,最后用酶标仪测定光密度值（OD），评定抗原-抗体的含量。,常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）,分类,双抗体夹心法,在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等,特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇,间接法ELISA,乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法,2)免疫荧光技术(ImmunofluorescenceTechnique)用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法,常用荧光素异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。用途：细胞表面CD分子抗核抗体,3)放射免疫测定法（RIA）用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法敏感度可达pg水平，其标记物为125I、131I等。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。,4)发光免疫分析(luminescenceimmunoassayLIA)将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。,化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺生物发光免疫测定萤火虫、发光水母化学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）电化学发光免疫测定,5)免疫胶体金技术,用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法,6)免疫印迹法（Westernblotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于检测多种蛋白质,免疫印迹法示意图,4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA蛋白质、RNA蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。,原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。,第三节免疫细胞功能的检测,免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离,(一)外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,密度梯度离心(Ficoll)离心,（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析,免疫吸附分离法免疫磁珠法荧光激活细胞分离仪分离法（(FluorescenceActivatedCellSorting)，FACS）抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL,2.免疫磁珠细胞分离,免疫磁珠法细胞分选过程,3.荧光激活细胞分离仪分离法流式细胞术(flowcytometry,FCM),全自动细胞分选系统,流式细胞分析仪,流式细胞仪的工作原理和基本结构,待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。流动室充满IsoFlow，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。,4.抗原肽-MHC分子四聚体是一种药品的名字，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面,抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL,二细胞免疫功能检测,T细胞功能测定B细胞功能测定,（1）T淋巴细胞增殖试验,原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,1）形态学检查法,2）3H-TdR掺入法,优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,3H-TdR或125I-UdR掺入法,3）MTT比色法,(2)迟发型超敏反应检测,2.B细胞功能测定,单扩ELISA速率比浊法测定各类免疫球蛋白含量抗体形成细胞测定,（2）溶血空斑试验,原理：,临床应用与评价,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,B细胞抗体形成功能的检测酶联免疫斑点法,原理：,应用与方法学评价：,该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,ELISPOT技术简介,酶联免疫斑点试验(Enzymelinkedimmunospotassay)80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。,ELISPOT的基本原理,细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。,稳定、特异，且抗原用量少可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞,ELISPOT检测抗体分泌,ELISPOT分析系统,酶联斑点读板仪,3.细胞毒试验,原理：,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定射线,意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,（1）51Cr释放法,（2）乳酸脱氢酶释放法,（3）细胞染色法,(4)凋亡细胞检测法,细胞坏死（细胞被动性死亡）细胞受到急性强力伤害时，立即出现的早期反应。是病理条件下细胞死亡的过程。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症,细胞凋亡（细胞主动性死亡）多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD).从严格的词学意义上来说，PCD与凋亡是有很大区别的,细胞凋亡检测方,形态学方法,电泳法,在细胞凋亡时，内源性mg2+、ca2+依赖性核算内切酶被激活，对DNA的切割有3种形式。即核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂以及DNA单链的断裂。琼脂糖凝胶电泳时，可观察到特征的梯状（ladder）DNA条带,TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling(TUNEL)细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA碎裂成片段(DNAfragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息.原位末端标记技术可以检测到形态改变之前的凋亡细胞，敏感性高，特异性强，为凋亡细胞计数提供了基础,原位缺口末端标记法,流式细胞术测定法,细胞凋亡时，AnnexinV（一种分子量在35-36kD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白）能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。以标记FITC的AnnexinV作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。PI(Propidiumiodide)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过而使细胞