聚合物胶束在载抗癌药领域的应用毕业论文

苏州大学本科生毕业论文1目录中文摘要2外文摘要4第一章前言11肿瘤治疗简介（CANCERTHERAPY）612纳米载体的分类和生物应用6121脂质体（LIPOSOMES6122聚合物纳米粒7123聚合物前药7124聚合物胶束7125聚合物囊泡8131聚合物胶束组成8132聚合物胶束的制备9第二章还原敏感聚乙二醇载药还原条件可控释放21引言10苏州大学本科生毕业论文222实验部分11221试剂与仪器11222PEGPDLLA的合成11223胶束的制备12224胶束在还原性条件下交联12第三章结果与讨论31PEGPDLLA的合成1332PEGPCDCPDLLA的合成1333聚合物胶束的制备，还原性条件下交联及表征1534聚合物胶束对抗癌药物阿霉素（DOX）的包裹和控制性释放及其表征16第四章结论及其展望17参考文献18致谢20苏州大学本科生毕业论文3苏州大学本科生毕业论文4还原响应聚合物胶束在载抗癌药领域的应用摘要癌症与心脑血管病已经成为人类的主要死因。在发达国家，被列为主要死因。在人类与肿瘤的斗争中，已经发现了好多种抗癌药物，主要分为化学药物和蛋白质类药物。但是蛋白质类药物在人体中易于被破坏，对人的副作用比较大，近年来人们发现聚合物胶束载药可以应用于包裹药物，因此刺激响应高聚物胶束在药物释放领域得到越来越广泛的应用。常用的聚合物胶束响应释放药物包括还原性响应，PH响应，温度响应。目前研究最多的是PH响应的，但是PH响应存在的问题是药物释放慢，这样会降低治疗的效果，增加细胞的耐药性，不利于治疗。大量的研究发现，细胞中存在还原性物质GSH，是细胞外GSH浓度的100到1000倍。因此，细胞内部有很强的还原环境，而细胞外面则是氧化环境。因为双硫键在氧化环境中很稳定，而在还原条件下可以快速降解，这样便可以释放出抗癌细胞药物，可以实现靶向治疗的效果。关键词聚合物胶束；还原响应；载药；胶束制备；双硫键作者XXX指导教师XX副教授苏州大学本科生毕业论文5ABSTRACTCANCERISALREADYASERIOUSHAZARDTOTHEHEALTHOFPEOPLE,ANDCARDIOVASCULARDISEASEWHICHHASBECOMEAMAJORCAUSEOFDEATHINHUMANS,INDEVELOPEDCOUNTRIESITISTHEMAINCAUSEOFHUMANDEATHINHUMANSSTRUGGLEWITHCANCER,FINDINGTHATAGOODVARIETYOFANTICANCERDRUGS,MAINLYDIVIDEDINTOCHEMICALDRUGSANDPROTEINDRUGSHOWEVER,PROTEINDRUGSINTHEBODYISEASYTOBEDESTROYED,THESIDEEFFECTSOFHUMANLARGE,INRECENTYEARS,ITWASFOUNDTHATTHEDRUGCANBEAPPLIEDTOTHEPOLYMERMICELLEDRUGPACKAGE,SOSTIMULIRESPONSIVEPOLYMERMICELLEDRUGCARRIERRELEASEFIELDSINCREASINGLYTHEMOREANDMOREUSEFULCOMMONRESPONSETOTHERELEASEOFDRUGS,INCLUDINGPOLYMERICMICELLESREDUCINGRESPONSE,ANDPHANDTEMPERATURERESPONSETHEMOSTSTUDIEDISTHERESPONSEOFPH,PHRESPONSEBUTTHEREISAPROBLEMOFDRUGRELEASESLOWLY,THISWILLREDUCETHEEFFECTOFTHETREATMENTMANYSTUDIESHAVEGOTTHATTHEPRESENCEOFREDUCINGSUBSTANCESGSHCELLS,IS100TO1000TIMESTHECONCENTRATIONOFEXTRACELLULARGSHTHEREFORE,THEINTERNALCELLSHAVEASTRONGREDUCINGENVIRONMENT,WHILEOUTSIDETHECELLISANOXIDIZINGCONDITIONBECAUSEDISULFIDEBONDSARESTABLEINANOXIDIZINGCONDITION,ANDUNDERREDUCINGCONDITIONSCANBERAPIDLYDEGRADED,ITWILLRELEASETHEDRUGSOASTOACHIEVETHEEFFECTOFTARGETEDTHERAPY苏州大学本科生毕业论文6KEYWORDSPOLYMERICMICELLESRESTORERESPONSEDRUGDELIVERMICELLEPREPARATION；DISULFIDEBONDWRITTENBYSUPERVISEDBY苏州大学本科生毕业论文7第一章前言11肿瘤治疗简介CANCERTHERAPY恶性肿瘤所造成的死亡人数在持续上升。它与心脑血管病已经成为人类的主要死因，在发达国家，更是主要死因。因此，对于癌症的治疗，引起了众多研究者的重视。目前治疗癌症的主要方法有手术，放射线疗，化治疗，单克隆抗体，还有中医疗法。而化学疗法是目前最为广泛使用的治疗措施，化疗的治病机理是化学药物可以作用于细胞的有丝分裂，使癌细胞不能完成完整的分裂增殖，从而死亡。虽然化疗对癌症的治疗有一定的效果，但是它没有特异性，在人体中不但会杀死癌细胞，对人体正常的细胞也会造成伤害，这样患者就会出现掉头发呕吐等症候，影响了患者的生存质量。同时，普通的化学治疗由于没有靶向的作用，治疗效果也不理想。近年来，人们发现100到200纳米的粒子可以通过肿瘤组织的EPR效应富集在肿瘤中，有靶向被动性能。纳米粒子作为运输药物的载体时有一些显著优点（1）靶向到病发部位，使病变部位药物浓度高，正常部位浓度低，这样可以提高治疗的效果，减少副作用。（2）可以让一些疏水的药物溶解，方便静脉给药。（3）减少被人体清理的作用，延长作用时间。（4）可以在病灶恒定释放，提高药理学效果。（5）可以穿透血脑屏障，细胞膜等生物屏障苏州大学本科生毕业论文8对药物的阻隔1。（6）保护药物不被人体太快的降解，提高药物效用。2612纳米载体的分类及其在生物学上的应用常见纳米载体有高聚物纳米粒，聚合物前药，高聚物胶束，聚合物囊泡和脂质体。121脂质体（LIPOSOMES）是一种天然或者人工合成的膜。其中头部磷脂分子亲水，疏水尾部伸入空气中，在水中形成双层脂分子的球形脂质体，直径在251000NM之间。利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，可以将药物送入细胞内部。它的好处在于与人体相容性好，药物稳定性较好，可以被动靶向运输到病变部位，降低副作用，目前阿霉素等已经用于临床。但是脂质体有一定的局限性，主要表现有载药率较低，在血液中容易泄露，稳定性差等。LIPOSOME122高聚物纳米粒POLYMERICNANOPARTICLES苏州大学本科生毕业论文9高聚物纳米粒是由聚合物自组装形成的固态胶体颗粒，粒径通常在10到1000纳米之间。可通过溶解，成键，吸附或者包囊等形式载药。与其他载药体类似，纳米粒可以靶向运输药物到病变处，提高疗效，降低副作用。尤其是可以提高蛋白质类药物的效果，实现药物控制释放7。这方面的作用得到广泛的研究，其中一些纳米粒形式的药物已经被用于临床试验中。8123聚合物前药POLYMERDRUGCONJUGATES聚合物前药是通过化学键将药物与可降解的聚合物连接起来得到纳米尺度的结构。目前这种方法已经用于蛋白质，多肽及其小分子抗癌药物，可以提高疗效10。具有靶向性，还有比较低的免疫原性9。目前已有前药（PEG化的左旋天冬氨酶ONCASPAR）已经被FDA批准用于治疗白血病。但是因为它是通过化学键将药物和高聚物连接，所以不利于释放，不利于治疗。124聚合物胶束POLYMERICMICELLES高分子胶束是由两亲性共聚物在水相中形成的具有疏水性内部，亲水外表面的一种纳米粒子，他的粒径在10到200纳米之间，疏水性的内部可以很好的溶解憎水性药物，而亲水的外壳可以让胶束稳定的分散在水中。因为它在人体中存在时间长，载药效果好，已经进苏州大学本科生毕业论文10行了相当多的研究。910相比小分子表面活性剂，高聚物胶束不仅对人体正常的细胞无毒，而且相对来说比较稳定，可通过分子设计实现多重环境响应性和可控释放药物。虽然癌症靶向治疗很有疗效，全世界也深入广泛的开展了研究，但是在化学药物上目前还没有实现药物特定运送和可控释放到肿瘤部位的满意的解决方案11，12。近年来，高聚物胶束广泛用于运载DOX和PTX，其中一个胶束形式的PTX药物（GENEXOLPM）已经在韩国应用于治疗肺癌，乳腺癌等13。125聚合物囊泡（POLYMERSOMES）聚合物囊泡是由两亲性聚合物在水溶液自组装的聚集体，内部是亲水性的腔体，由高聚物疏水链段和外界隔开14。聚合物囊泡由于其特殊的形状，近年来受到了很多的关注，成为你目前比较热门的药物输送体。与胶束不同的是，它不但可以包裹亲水的，而且可以包裹疏水的。例如DISCHER等人研发的运载PTX和阿霉素亚酸盐的PEGBPCL可以有效抑制癌细胞15。苏州大学本科生毕业论文1113聚合物胶束131聚合物胶束的组成胶束是由两亲共聚物在水相中形成的具有疏水性内部，亲水外表面的一种核壳状纳米粒子，他的粒径在10到200纳米之间，疏水性的内部可以很好的溶解憎水性药物，而亲水的外壳可以让胶束稳定的分散在水中。常用的亲水聚合物有葡聚糖壳聚糖PEG，PVP,PMPC等。其中PEG应用最为广泛，本论文就是用的PEG。132聚合物胶束的制备聚合物胶束制备主要应用其化学性质，常用的有以下方法。（1）直接溶解法将疏水性比较弱的聚合物直接溶解在水中，通过溶解使其自组装形成胶束。（2）溶剂挥发法首先将聚合物充分溶解于与水互溶的有机溶剂（如丙酮，乙醇）中，然后在搅拌情况下缓慢滴加入水，加完后在室温下搅拌使得有机溶剂完全挥发，就得均匀分布的聚合物胶束。（3）透析法首先把高聚物溶在和水可以很容易互溶的有机溶剂，然后用透析法以除去有机溶剂，得到稳定的胶束。（4）水包油乳液法首先将聚合物充分溶解在与水不互溶且容易挥发的机溶剂，然后快速加入水并超声搅拌使其乳化，之后再挥发有机溶剂得到稳定的聚合物胶束。（5薄膜水化法使胶束溶在易挥发有机溶剂中，然后用旋转蒸发仪旋蒸以除去有机溶剂，使瓶中形成一层铺展均匀的薄膜，然后真空干燥。之后向瓶中加入水，在超声搅拌下使得薄膜完全水合即可得到分布比较均匀的聚合物胶束。苏州大学本科生毕业论文12胶束的制备方法也可以用于载药，载药方法包括直接溶解，水包油乳液法，透析和薄膜水化法。而直接溶解法则是把胶束和药物直接溶在水溶液中，在充分搅拌下形成载药胶束，只能用于疏水性弱的药物包裹，其他三种方法则是将药物与聚合物一起溶在有机溶剂然后再进行，可以包强疏水性的药物。16第二章还原敏感聚乙二醇载药还原条件可控释放21前言目前，载药物质运载抗肿瘤药研究取得很多成就，包括PH，温度，还原性等的可控释放。但是PH响应存在的问题是药物释放慢，这样会降低治疗的效果，造成耐药性增强。大量的研究发现，细胞中存在还原性物质GSH，是细胞外GSH浓度的100到1000倍。因此，细胞内部有很强的还原环境，而细胞外面则是氧化环境。因为双硫键在氧化环境中很稳定，而在还原条件下可以快速降解，这样便可以释放出抗癌细胞药物，可以实现靶向治疗的效果。本章主要设计了合成双硫键连接PEG和PDLLA交联的PEDPCDCPDLLA，并用它包裹DOX，DTT在低浓度条件下使SS键断裂而交联，将药物包裹在其中，在高浓度DTT还原条苏州大学本科生毕业论文13件作用下释放药物，用荧光标记法表征了药物释放的浓度。DTT（二硫苏糖醇）22实验部分221试剂和仪器试剂聚乙二醇（PEG），盐酸，二硫苏糖醇（DTT），氢氧化钠氮氮二甲甲酰胺（DMF）,DMSO,十二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸氢二钠，PCDC,PDLLA,阿霉素（DOX），HEPES，二次水。苏州大学本科生毕业论文14仪器核磁氢谱UNITINOVA400型共振波谱仪（NMR），采用氘代氯仿为溶剂，化学位移以溶剂峰为参考标准。聚合物的分子量以及分子量分布由凝胶色谱仪GPC测定，使用WATERS1515高效液相色谱泵，RI2410检测器和MZGEL凝胶柱，以THF为流动相，流动速率为10ML/MIN,温度为30，用单分散线性聚苯乙烯（PS）作标样。纳米粒径仪（DLS），扫描隧道显微镜（TEM），荧光光谱仪。222PEGPDLLA的合成PEGPDLLA500030001称量PEG1克，精确到小数点后三位2先用甲苯溶解PEG，用注射器吸取溶剂（每次05毫升），将溶解了的PEG用胶头滴管打入密闭反应器中，没有溶解的再用溶剂润洗至完全溶解3用甲苯溶解DLLA（每次05毫升），将溶解的先用胶头滴管打入密闭反应器中，再用甲苯润洗至完全溶解，再滴加辛酸亚锡滴入小瓶子，需用甲苯先稀释辛酸亚锡，再加入密闭反应器，防止辛酸亚锡局部浓度过高，使反应快速进行，对实验造成影响。4将密闭反应器封好，其他东西包好放入传递窗，在出来取出，将密闭反应器转到110油锅，反应两天。反应后处理PEG,PDLLA反应结束需先冷却半个小时1滴两滴冰醋酸（作终止剂，冰醋酸会和催化剂反应，将催化剂除去，反应终止）2在冰乙醚中沉淀，将甲苯除去3抽滤4放入真空干燥箱总抽真空（除去乙醚）PEGPCDCPDLLA的合成苏州大学本科生毕业论文1505G012G04G量准确到小数点后两位1称量PEG的量05克。先用二氯甲烷溶解PEG，用注射器吸取溶剂（每05毫升一次）将溶解好的PEG用胶头滴管打入密闭反应器中，再用DCM润洗每溶解的PEG，至都溶解。3再用DCM溶解CDC（每一次05毫升），将溶解的先用胶头滴管打入密闭反应器中，再用DCM润洗，至完全溶解，再滴一次ZINC（催化剂）滴入小瓶子，再用胶头滴管滴入密闭反应器，需用DCM先稀释ZINC（再加入密闭反应器，防止ZINC局部浓度过高，使反应快速进行，对实验造成影响）。4将密闭反应器约好，其他东西包好放入传递窗，再出来取出，转到40油锅，反应快。5将密闭反应器和其他东西包好转入传递箱（有液体需注意）6称DLLA，用DCM溶解，将先溶解的用胶头滴管滴入密闭反应器。再用DCM润洗没溶解的DLLA至完全溶解，再加入2MIN（先用DCM溶解）7反应完全转入40与油锅反应两天。223胶束的制备1称取5MGPEGPCDCPDLLA溶于5MLDMF里面为溶液，放在37恒温摇床半小时，取200微升溶液滴加入800微升HEPES缓冲液（PH74），测粒径DLS。将上述溶液用PB（PH74）透析24小时，测粒径（DLS）将上述溶液稀释100倍，测定DLS对照组称取5MGPEGPDLLA溶于5MLDMF，在37恒温摇床溶解半小时，如上滴加，静置半小时，测粒径（DLS）将上述溶液用PB（PH74）透析24小时，测粒径（DLS）将上述溶液稀释100倍，测DLS苏州大学本科生毕业论文16224胶束在还原性条件下交联将取5MLHEPES缓冲液，搅拌情况下通氮气45MIN，称取5MGDTT在通氮气情况下加入到上述溶液。取21微升DTT溶液加入透析好的胶束溶液，在37恒温摇床反应1H，测DLS第三章结果与讨论31PEGPDLLA的合成在手套箱里面，用甲苯溶解PEG与PDLLA，并将其用注射器加入密闭反应器。将稀释好的辛酸亚锡加入，防止辛酸亚锡局部浓度过高，将密闭反应器封好，其他东西放入传递窗，在取出，将密闭反应器转移到110油锅，反应两天。反应结束，先冷却半小时，然后后滴加苏州大学本科生毕业论文17两滴冰醋酸终止反应（将催化剂除去），在乙醚中沉淀，将甲苯除去，放入真空干燥箱。PEGPDLLA的HNMR氢谱如下，通过特征吸收峰，可以确定是所需产物。32PEGPCDCPDLLA的合成在手套箱里面，用二氯甲烷溶解PEG，溶解好后加入密闭反应器，再用二氯甲烷溶解CDC，将溶解好的CDC用注射器加入密闭反应器。用DCM稀释ZINC，稀释好后，将其加入密闭反应器。将密闭反应器转移到40油锅，称取DLLA，用DCM溶解，再加入密闭反应器，将反应转入40油锅反应两天。PEGPCDCPDLLA的HNMR氢谱如下，可以通过特征氢谱确定就是所需产物。苏州大学本科生毕业论文18产物表征33聚合物胶束的制备，还原性条件下交联及表征聚合物胶束是用透析法制备，称取5MGPEGPCDCPDLLA溶于5MLDMF里面为溶液，放在37恒温摇床半小时，取200微升溶液滴加入800微升HEPES缓冲液（PH74），测粒径DLS。得到的粒径及粒径分布如下表所示SIZEPDIPEGPCDCPDLLA14850162苏州大学本科生毕业论文19将上述溶液用PB（PH74）透析24小时，测粒径（DLS）SIZEPDIPEGPCDCPDLLA12060167将上述溶液稀释100倍，测定DLSSIZEPDIPEGPCDCPDLLA23940275对照组称取5MGPEGPDLLA溶于5MLDMF，在37恒温摇床溶解半小时，如上滴加，静置半小时，测粒径（DLS）SIZEPDIPEGPDLLA15440127将上述溶液用PB（PH74）透析24小时，测粒径（DLS）SIZEPDIPEGPDLLA17860161胶束在还原性条件下交联将取5MLHEPES缓冲液，搅拌情况下通氮气45MIN，称取5MGDTT在通氮气情况下加入到上苏州大学本科生毕业论文20述溶液。取21微升DTT溶液加入透析好的胶束溶液，在37恒温摇床反应1H，测DLSSIZEPDIPEGPCDCPDLLA（交联）15140107稀释100倍，测DLS得SIZEPDIPEGPCDCPDLLA13000283101002468101214CROSLINKEDPEGCDPLAMICELVOLUMESIZENMDLS分布图TEM图DLS测试结果显示，交联的聚合物胶束粒径变小，粒径分布也比较小。交联后，我们用HEPES缓冲溶液高倍稀释来验证胶束的稳定性。这说明交联的胶束很稳定。34聚合物胶束对抗癌药物阿霉素（DOX）的包裹和控制性释放及其表征苏州大学本科生毕业论文21载药量（DLC）包封率（DLE）设计载药量PEGPCDCPDLLA（交联）11566537167PEGPCDCPDLLA（不交联）9955526167PEGPDLLA9115014167DLC包载药物的质量/包载药物质量聚合物质量DLE实际包载药物质量/理论包载药物质量第四章结论及其展望苏州大学本科生毕业论文22结论本论文合成了PEGPCDCPDLLA，并通过透析法制备了聚合物胶束，模拟了癌细胞内部的还原性环境，在还原性（DTT）条件下聚合物胶束内部发生交联，运载抗癌药物阿霉素（DOX），并通过荧光光谱仪表征了药物的释放效果。具体如下1合成PEGPDLLA2合成PEGPCDCPDLLA3制备聚合物胶束4在少量DTT引发剂条件下让聚合物胶束交联5用交联的聚合物胶束运载抗癌药物阿霉素。6用荧光光谱仪测定药物释放浓度展望接下来需要做的工作1通过细胞实验验证聚合物胶束的靶向性2通过动物实验验证抗癌效果苏州大学本科生毕业论文23参考文献1NAIRLS,LAURENCINCT,BIODEGRADABLEPOLYMERSASBIOMATERIALS,PROGRESSINPOLYMERSCIENCE2007,3289,7627982TIANH,TANGZZHUANGX,CHENX,JINGX,BIODEGRADABLESYNTHETICPOLYMERSPREPARATION,FUNCTIONALIZATIONANDBIOMEDICALAPPLICATION,PROGRESSINPOLYMERSCIENCE2012,372,2372803LEDLEINA,LANGERR,PLASHAPEMEMORYTISSUEBIODEGRADABLE,ELASTICSHAPEMEMORYPOLYMERSFORPOTENTIALBIOMEDICALAPPLICATIONS,SCIENCE2002,2965573,167316764CHENR,CURRANSJ,CURRANJM,HUNTJA,THEUSEOFPOLYLLACTIDEANDRGDMODIFIEDMICROSPHERESASCELLCARRIERSINAFLOWINTERMITTENCYBIOREACTORFORTISSUEENGINEERINGCARTILAGE,BIOMATERIALS2006,2725,44534460苏州大学本科生毕业论文245VASIRJK,LABHASETWARV,BIODEGRADABLENANOPARTICLESFORCYTOSOLICDELIVEROFTHERAPEUTICS,ADVANCEDDRUGDELIVERYREVIEWS2007,598,7187286PORTERJR,HENSONA,POPATKC,BIODEGRADABLEPOLYCAPROLACTONENANOWIRESFORBONETISSUEENGINEERINGAPPLICATIONS,BIOMATERIALS2009,305,7807887SOPPIMATHKS,AMINABHAVITM,KULKARNIAR,RUDZINSKIWE,BIODEGRADABLEPOLYMERICNANOPARTICLESASDRUGDELIVERYDEVICES,JOURNALOFCONTROLRELEASE2011,7012,1208苏州大学博士学位论文孙欢利9DUNCANRPOLYMERCONJUGATESASANTICANCERNANOMEDICINES,NATUREREVIEWSCANCER2006,69,68870110ZHANGQ,KONR,OHJK,COMMUN,2012,487542755211蒋序林，李丽花，卓仁禧中国发明专利，CN2009102731570,201191412DENGC,JIANGY，CHENGR，MENGFH，ZHONGZYNANOTODAY，2012，7（5）4648013LAMMERST，KIESSLINGF，HENNINKWE，STORMGJCONTROLRELEASE，2012，161（2）17518714DENGM,WUJ,REINHARTKINGCA,CHUCC,BIODEGRADABLEFUNCTIONALPOLYESTERAMIDESWITHPENDANTHYDROXYLFUNCTIONALGROUPSSYNTHESIS,苏州大学本科生毕业论文25CHARACTERIZATION,FABRICATIONANDINVITROCELLULARRESPONSE,ACTABIOMATERIALIA2011,74,1504