发酵工程考试题.doc

.2、试述发酵过程pH变化的原因是什么？答：1、基质代谢：（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降 2、产物形成 ：某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升 3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。4、PH对微生物细胞的生长和发酵代谢产物的影响有哪些？生产上怎样控制发酵过程的PH? 发酵过程的pH 控制可以采取哪些措施？答：p值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用；P值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。控制：首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。如果达不到要求，还可在发酵过程中补加酸或碱。过去是直接加人酸(如H2SO4)或碱(如NaOH)来控制，现在常用的是以生理酸性物质(NH)4SO4和生理碱性物质氨水来控制，它们不仅可以调节pH值，还可以补充氮源。当发酵液的pH值和氨氮含量都偏低时，补加氨水，就可达到调节pH和补充氨氮的目的；反之，pH值较高，氨氮含量又低时，就补加(NH)4SO4。此外，用补料的方式来调节pH值也比较有效。可采取的策施：1）调整培养基组分。2）在发酵过程中进行控制。添加CaCO3，氨水流加法 尿素流加法 在补料与pH 没矛盾时，采取补料调pH.在补料与pH有矛盾时，加酸碱调节pH 。5、pH对发酵过程的影响：1、是微生物细胞原生质膜的电荷发生改变。2、直接影响酶的活性。3、直接影响代谢过程（菌体代谢方向、代谢产物合成）。影响pH的因素：1、基质代谢。2、产物形成。3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。导致pH下降的因素：C/N过高；溶氧不足；消泡剂过量、脂肪酸增加；生理酸性物质存在。导致pH上升的因素：C/N过低；生理碱性物质存在。（pH上升是补料标志）7、什么叫染菌，对发酵有什么影响，对提炼有什么危害？对产品质量有什么影响？答：染菌：发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖染菌对发酵的影响：发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤;造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失;扰乱生产秩序，破坏生产计划;遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性;影响产品外观及内在质量发酵染菌对提炼的影响：染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯发酵染菌对过滤的影响: 染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想.；污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。8、不同时间染菌对发酵有什么影响，染菌如何控制？答:（1）种子培养期染菌：由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）发酵前期染菌：发酵前期最易染菌，且危害最大。原因:发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。措施 :可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌 ：发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施 :培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌：发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。发酵染菌后的措施：染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒l9、分析发酵生产中杂菌污染的途径以及一旦发现染菌应采取的挽救措施（试论述国内外抗生素工厂发酵染菌的原因有哪些？）答：发酵生产中杂菌污染途径包括以下几个方面：1)种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。2)无菌空气带菌。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。3)培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。4)设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。5)操作失误和技术管理不善也会引起染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。发酵生产中一旦发现污染杂菌，应考虑采取以下措施：1)首先应尽力寻找染菌的原因和途径，杜绝后患。2)同时，对染菌的发酵液要根据具体情况做出处理。例如：发现种子染菌，应立即加热灭菌后废弃，绝对不能将染菌种子接入发酵罐，以免造成更大损失，如果是发现早期染菌，则可采取适当补充营养物，重新灭菌，再接种发酵；如果在发酵中后期染菌，而杂菌又不影响生产菌株的正常发酵或不妨碍产品的分离、提纯，则可让其“共生共长”、“和平共处”至发酵终了，否则就应提前放罐。(3分)3)染菌后的挽救措施要根据不同生产菌株的特点、产品性质以及各工厂的具体情况，采取可行办法。10、如何诊断发酵感染了噬菌体？污染噬菌体对发酵的影响及其产生的原因。有何防止措施?（1）发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验。产生噬菌体的原因:通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害，经过12年以后，主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也携带着噬菌体到处传播，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐（2）噬菌体的防治：1、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间4、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。5、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。 6、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。12、请简述发酵过程中污染不同种类和性质的微生物的影响。答：（1）污染噬菌体：噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。 （2）污染其它杂菌：有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。14、染菌隐患的检查：1、显微镜检查法（革兰氏染色）2、平板划线培养或斜面培养检查法。3、肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）。4、发酵过程异常现象观察法。染菌的预防措施：1、强化空气净化过程。2、严格培养原料及设备的灭菌。3、定期检测发酵设备及管道。4、严格培养物的移接。5、预防噬菌体危害。16、如何选择最适发酵温度？答：1、根据菌种及生长阶段选择。微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。2、根据培养条件选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。18、简述温度对微生物生长和发酵的影响。答：任何微生物的生长温度均在一定范围内，可用最高温度,最适温度和最低生长温度进行描述。温度影响微生物生长的机理：(1)影响酶活性；(2)影响细胞膜的流动性；(3)影响物质的溶解度。温度对发酵的影响：(1)影响产物生成速度；(2)影响发酵液性质；(3)影响产物种类：a.改变体内酶系中间产物种类产物种类；b.使代谢比例失调控制：发酵设备上装有热交换设备。20、温度对发酵的影响主要表现在哪些方面？1.温度对微生物细胞生长的影响2. 温度对产物形成的影响3. 温度影响发酵液的物理性质4.温度影响生物合成的方向 21、发酵过程温度选择有什么依据？（1）根据菌种及生长阶段选择：前期：提高温度，以促进菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速中期：为了延长中期，比前期温度稍低一些，可以延迟衰老。（2）根据培养条件选择通气条件差降低温度，使细菌呼吸速率降低，溶氧量提高培养基稀薄降低温度，减慢营养利用速率（3）根据菌生长情况生长快维持在较高温要短些，反之，长些。营养丰富，通气量足够，前期温度高些22、温度对发酵的影响：1、最适温度范围内，生长速度随温度升高而增加，缩短微生物生长周期。2、最适温度下可缩短生长缓慢期和孢子萌发时间。3、较低温度，氧溶解度大、通气量充足、生长速率相对较低。4、生长延迟期主要取决于温度，生长后期主要取决于溶解氧。23、为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？答：培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。26、请分析泡沫产生的原因，泡沫对发酵的影响有哪些？生产上怎样控制发酵过程所产生的泡沫？ 答:发酵过程泡沫产生的原因 1、通气搅拌的强烈程度通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。 2、培养基配比与原料组成培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。3、菌种、种子质量和接种量 菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量 4、灭菌质量 培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。影响1)泡沫过多，升到罐顶从轴封渗出，易造成染菌2)使发酵罐装填系数减少，降低了设备利用率3)影响通风搅拌正常进行，影响氧的传递，妨碍菌的呼吸；4)增加菌群的非均一性，微生物随泡沫漂浮；5)造成产物的损失；6)加入消泡剂给下游提取工序带来困难。有益之处:气体分散，增加气液接触面积。控制：泡沫的控制，可以采用三种途径：调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度；采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫；还可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。对已产生的泡沫工业上采用机械消泡或者加消泡剂的方法。27、泡沫产生规律：1、通气量越大，搅拌越剧烈，则产生的泡沫越多。2、培养基中蛋白质含量越多，发酵液的粘度、浓度越大，则生成的泡沫稳定性就越高。3、菌体旺盛生长时，产生的泡沫多，当发酵液中营养基质被菌体大量消耗时，浓度下降，则气泡的稳定性也减弱，在发酵后期，伴随菌体的自溶，使发酵液中蛋白质浓度又上升，则发酵液的起泡性又增强。29、作为理想消泡剂应具有哪些条件？答：.在起泡液中不溶或难溶；.是表面活性剂表面张力低于起泡液，消泡作用迅速、效率高。.与起泡液有一定程度的亲合性；.与起泡液不发生化学反应；挥发性小，作用时间长。不干扰活性氧、等测定仪的使用，不影响氧的传递。来源方便、价格便宜，不会在使用和运输中引起任何危害，能受高温灭菌，对各物均无影响。30、选择消泡剂的依据：表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡效果明显。对气-液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡,与起泡液有一定程度的亲和性。无毒害性，对人、畜无害，不被微生物同化，对菌体生长和代谢无影响，不影响产物的提取和产品质量。 不干扰各种测量仪表的使用；不干扰溶解氧、pH等测定仪表使用，最好不影响氧的传递。在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能。来源方便，使用成本低。31、消泡剂的种类、性能和应用范围：天然油脂：玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等（豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体）聚醚类：聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)。（用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的1020倍）高碳醇、脂肪酸和酯类：如十八醇、聚二醇 （在水体系里是有效的消泡剂）硅酮类（聚硅油类） ：最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。聚二甲基硅氧烷及其衍生物 ：适用于放线菌和细菌发酵 （单独使用效果差，常与分散剂（微晶二氧化硅）一起使用）羟基聚二甲基硅氧烷 ：曾用于青霉素和土霉素发酵氟化烷烃：具有极其小的表面能32、发酵过程中溶解氧受哪些因素的影响？答：（1）搅拌。（2）温度 （3）发酵液浓度 （4）培养基 （5）气体组成成分。发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降；发酵中后期：溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等；发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升 。33、溶氧对发酵有何影响。提出几种有效提高溶氧的方法。答：溶氧对发酵的影响：氧是好氧微生物生长和代谢产物生成所必需，微生物只能利用溶解在发酵液的溶解氧，而氧难溶于水，培养基中贮存的氧量很少； 【纯氧溶纯水，1.26mmol/L；空气氧溶纯水，0.25mmol/L；培养基更低】，高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短， 加剧了对氧的需求；形成产物的最佳氧浓度和生长的最佳氧浓度有可能是不同的；发酵罐中氧的吸收率很低；若加大通气量会引起过多泡沫；消泡剂的使用不利于氧的溶解。提高溶氧的方法： 1.增大通风量。2.提高转速。3增加罐压。4改善发酵液的理化性质5优化空气中氧的含量6加入传氧中间介质34、论述溶解氧控制的意义.答：在发酵过程中，控制溶解氧浓度具有重要意义，表现在以下方面：1)在发酵过程中，微生物只能利用溶解状态下的氧。2)氧是难溶气体，在25、100MPa下，氧在纯水中的溶解度为0.25mmol/L，在发酵液中的溶解度为0.2mmol/L；在谷氨酸发酵的操作条件下，发酵液中氧的饱和浓度约为0.313mmol/L,这样的溶氧浓度菌的正常呼吸只能维持2030s。由于微生物不断消耗发酵液中的氧，而氧的溶解度很低，就必须采用强化供氧。3)氧的溶解度随着温度的升高而下降，随着培养液固形物的增多、或粘度的增加而下降。4)对于好气性发酵来说，氧传递速率已成为发酵产量和发酵周期的限制因素。同时，氧的供应不足可能引起生产菌种的不可弥补的损失或导致细胞代谢转向不需要的化合物的生成。5)发酵工业上氧的利用率很低。如抗生素发酵，被微生物利用的氧不超过经过净化处理的无菌空气中含氧量的2%；在谷氨酸发酵方面氧的利用率为10%30%。6)提高供氧效率，就能大大降低空气消耗量，从而降低设备费、减少动力消耗；且减少染菌机会，减少泡沫形成，提高设备利用率。35、溶解氧的测定方法有哪些？答：化学法，极谱法，复氧膜电极法，压力法37、临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。（微生物的临界氧浓度一般0.0030.05mmol/L）溶氧浓度（DO）：氧在水中的饱和浓度（C*）。发酵液氧浓度：CL供氧系数（氧传质系数）：KL（与空气线速度的次方成正比）dC/dT=KL（C*-CL）39、影响微生物需氧的因素有哪些？如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？答：因素：细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。如何调节：一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。40、氧从气相传递到细胞内要克服哪些阻力，其中最大阻力是哪一个？答：气膜传递阻力；气液界面传递阻力；气液界面通过液膜的传递阻力；液相主体的传递阻力；细胞表面的传递阻力；固液界面的传递阻力；细胞内的传递阻力；细胞壁的阻力；反应阻力。其中最大最大阻力是气液界面的传递阻力。41、请分析微生物对氧的需求并说明供氧的必要性。答：大多数的发酵过程都是好样发酵工程无论是基质的二氧化，菌体的生长还是产物的代谢均需要大量的氧。发酵所需的氧量很大程度上取决于培养基中碳源的性质。细胞的摄氧率与培养时间及细胞浓度有关。培养条件（如ph，温度等）对细胞的需氧要求也有影响。必要性：培养液内微生物所利用的只能是溶解氧，不可能一次供氧就满足微生物完全氧化葡萄糖或其他碳源对氧的需求。因此必须不断供氧。42、氧传递系数的测定方法有哪些？影响氧传递系数的因素有哪些？答：亚硫酸盐氧化法，取样极谱法，物料衡算法，动态法，排气法，复膜电极法。影响因素：溶液的性质，气液比表面积，搅拌，空气的线速度，空气分布管，培养液的性质，表面活性剂，离子强度，菌体浓度43、二氧化碳对发酵有何影响？如何控制？1.CO2对菌体生长具有抑制作用。 当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。2.CO2对发酵的影响对发酵促进。如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。对发酵抑制。如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制影响发酵液的酸碱平衡 CO2在发酵液中的浓度变化不像溶解氧那样有一定的规律。它的大小受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小、设备规模等。对CO2浓度的控制主要看其对发酵的影响，如果对发酵有促进作用，应该提高其浓度；反之，应降低其浓度。提高通气量和搅拌速率，有利于CO2的排出。降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中的浓度。CO2的产生与补料控制有密切关系。如补糖可降低发酵液中CO2的浓度，并降低培养液的pH值。44、简述谷氨酸的生物合成途径答：大致是：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成酮戊二酸。酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH+4存在的条件下，生成谷氨酸。45、作为谷氨酸产生菌，应具备哪些生理特征？从菌的生理特征上，谷氨酸产生菌应具备的条件：（1）生物素缺陷型，细胞膜对谷氨酸的通透性好 ；(2)CO固定酶活性强，丙酮酸脱羧酶活性不能太强；(3)-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺损；(4)谷氨酸脱氢酶活力高（此活性不被低浓度产物谷氨酸所抑制）；(5)NADPH+H+进入呼吸链能力弱；(6)异柠檬酸裂解酶活性不能太强，异柠檬酸脱氢酶活性强 。 46、以谷氨酸发酵为例，说明发酵温度、pH、通气量等环境条件对谷氨酸产生菌的影响。温度：谷氨酸发酵前期长菌阶段和种子培养时应满足菌体生长最适温度。若温度过高，菌体容易老化。PH：谷氨酸生产菌在中性和碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酸和N-乙酰谷氨酰氨。通气量：好氧性发酵通常需要供给大量的空气才能满足菌体对氧的需求。过高的溶解氧对次级代谢产物的合成未必有利，因为溶解氧不仅为代谢提供氧，同时也造成一定的微生物的生理环境，它可以影响培养基的电位，有时会称为逆向动力。过低的溶解氧会影响微生物的呼吸，进而造成代谢异47以谷氨酸发酵生产为例，分析在发酵过程中如何保证菌种生长和代谢的正常进行。答：首先，培养基中的营养物质应全面，缺乏营养物质，会影响菌种的生长繁殖及正常的代谢活动。如生物素是谷氨酸棒状杆菌的生长因子，缺乏生物素，谷氨酸的合成就会受到影响。其次，各种营养物质的比例和浓度会影响菌种的代谢途径等。如在碳源和氮源的比为31时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为41时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。第三，进行发酵过程中间控制，如温度、pH值、溶解氧等。当pH下降，呈酸性时，谷氨酸棒状杆菌就会生成乙酰谷氨酰胺。在发酵过程中，培养液的pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸时，培养液的pH就会下降。而碱性物质的消耗和氨的生成等则会导致培养液的pH上升。调节和控制培养液pH的方法有：在培养基中添加缓冲液，在发酵过程中加酸或碱。第四，染菌的控制。在种子扩大培养和发酵过程中，要严格控制杂菌的污染，通入的空气要进行严格的过滤除菌。48、分析影响谷氨酸发酵产量的因素及其调控机制答：在谷氨酸发酵过程中，影响菌种代谢途径的因素有氧、温度、pH和磷酸盐等，并且谷氨酸产生菌需要生长因子生物素。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。温度。菌种生长的最适温度为3032 。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到3437 。pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.08.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。49糖蜜的处理。糖蜜是甘蔗或甜菜制糖的副产物。发酵前对糖蜜进行稀释、酸化、灭菌及澄清等过程称为糖蜜前处理。糖蜜前处理的方法1、加酸通风沉淀法 稀释酸化 通风澄清 2、加热加酸沉淀法 加热稀释酸化 澄清稀释 3、添加絮凝剂澄清处理法 稀释酸化加热加絮凝剂澄清谷氨酸发酵的糖蜜预处理 特殊性：生物素限量 原理：产物谷氨酸积累到一定量会形成反馈抑制。需提高细胞膜的渗透性，使胞内的产生的谷氨酸迅速渗漏出去。细胞膜由磷脂双分子层和蛋白质组成，磷脂双分子层由脂肪酸、甘油、磷酸和侧链组成。把生物素控制在亚适量，才能生产出大量的谷氨酸。因为生物素是脂肪酸生物合成中乙酰-CoA羧化酶的辅基。谷氨酸发酵的糖蜜预处理的方法和各自原理1糖蜜预处理方法 除去过量生物素活性炭处理法 稀释，漂白粉，活性炭，过滤 原理：吸附树脂处理法 原理：吸附亚硝酸处理法 原理：破坏生物素2.添加化学药剂处理法 原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性添加青霉素法 添加表面活性剂 添加抗氧剂法3.追加糖蜜法原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。4.采用营养缺陷变异株 原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，是生物素不再影响谷氨酸的积累50、糖蜜可直接用作发酵原料吗？为什么？不可以。1、糖蜜中生物素的含量，与糖蜜来源生产批次有关，而且其它营养成份也有变动2、糖蜜含有黑褐色色素，影响成品色泽。3、糖蜜含有胶体物质，粘度大，致使发酵中泡沫多，对于提取也带来困难。4、糖蜜中含有较多的钙质物质，这对于谷氨酸的提取精制上，要增加糖蜜原料的脱钙操作。因此糖蜜要进行前处理。澄清，脱钙，水解胶体，除黑色素51、叙述防止发酵菌种退化的具体条件措施有那些？答：（1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。（2）创造良好的培养条件：如在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。（3）利用不易衰退的细胞传代：对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种就可避免这种现象。（4）采用有效的菌种保藏方法（5）合理的育种：选育菌种是所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞;合理选择诱变剂种类或增加突变位点，以减少分离回复突变；在诱变处理后及分离提纯化，从而保证保藏菌种的纯度。（6）、选用合适的培养基 在培养基中添加某种化学物质可以防止菌种退化。或者选取营养相对贫乏的培养基在菌种保藏培养基，限制菌株的生长代谢减少变异反而发生从而防止菌种的退化。52菌种退化的原因是什么？怎样防止菌种的退化？答：环境条件，菌种自身突变，突变不完全造成菌体遗传组成差异 防止：1退化菌种的复壮2提供良好的环境条件3进行合理的传代4采用优良的保藏方法5定期纯化菌种菌种退化：是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。52、菌种衰退的概念 指菌种整体在多次接种传代过程中逐渐造成生产能力降低，表现为发酵力（如对培养基的利用）或繁殖力（如孢子的产生）下降或发酵产物得率降低的现象。 菌种衰退的常见现象 1.菌落和细胞形态的改变 2.生长速度缓慢，产孢子越来越少 3.抵抗力、抗不良环境能力减弱等 4.代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降菌种衰退产生的原因 1.保藏不恰当 2.传代次数过多 3.发生回复突变 4.培养条件不适合 54、菌种的复壮概念 狭义：在菌种已衰退情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以恢复原有典型性状的措施。广义：在菌种未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。55、衰退菌种复壮的方法 单细胞菌株分离法 沸水筛选法 菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。 改变培养条件法 采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。 通过宿主体复壮 如Bacillus thuringiensis的复壮 诱变处理法 对发生回复突变进行重新诱变育种。56、分批发酵：1、定义：(分批培养)是指将所有的物料（除空气、消沫剂、调节pH的酸碱物外）一次性加入发酵罐，然后灭菌、接种、培养，最后将整个罐的内容物放出，进行产物回收。清罐结束后，重新开始新的装料发酵的发酵方式2、特点：非稳态培养过程、一次性投料一次性收获产品、封闭系 统、表现典型的生长周期（延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期）、稳定期细胞浓度最大 3、优缺点：设备要求低、操作简单、易于掌握、适用于固体颗粒或较多泡沫的培养基灭菌、适用于小发酵罐中培养基的灭菌；不能使细胞始终处于最优条件、对培养基营养成分破坏较大，反复加热冷却使能耗增加、发酵周期延长、降低了发酵罐利用率。补料发酵：1、定义：（半连续培养、半连续发酵）是指发酵中后期养料逐渐消耗，菌体逐渐走向衰老自溶，代谢产物不能再继续分泌，为延长中期代谢活动，维持较高的发酵产物的增长幅度，给发酵罐间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。2、特点：介于分批发酵和连续发酵之间的一种微生物细胞的培养方式 3、优缺点：维持菌体浓度、减缓供氧矛盾、避免发酵过早结束。与分批培养方式比较：可以解除培养过程中的底物抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖的分解阻遏效应。对于好氧过程，可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长、好氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况。微生物细胞可以被控制在一系列的过滤态阶段，可用来控制细胞的质量；并可重复某个时期细胞培养的过渡态，可用于理论研究。与连续培养方式比较 不需要严格的无菌条件。不会产生微生物菌种的老化和变异。最终产物浓度较高，有利于产物的分离。适用范围广。连续发酵：1、定义：（连续培养、开放式培养）是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养液，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式2、特点：微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。3、优缺点：温度较高、灭菌时间短、培养基营养成分得到最大限度的保护 简化操作步骤、缩短发酵周期、提高设备利用率、降低了人力物力的消耗、降低劳动强度、增加生产效率；连续发酵运转时间长，菌种多退化、易污染，培养基利用率一般低于分批发酵 工艺中的变量较分批发酵复杂，较难控制和扩大，且对蒸汽和设备要求较高 不适合含有大量固体物料培养基的灭菌，生产次生代谢产物时一般不用连续发酵，因为生产次生代谢产物所需的最佳条件，往往与其产生菌种生长所需的最佳条件不一致，有的还与微生物细胞分化有关。57比较分批培养和连续培养的优缺点。答：分批培养的优点：不易染菌，操作简单，不存在菌种老化或变异等问题。缺点：生产时间长，设备利用率低。连续培养的优点：1.提高设备利用率，缩短生产时间。2.发酵中各种参数恒定，便于自动化控制。3易于分期控制。4维持低基质浓度。缺点：菌种变异可能性较大，严格要求无菌条件。58与传统的分批集中补料培养相比，补料分批培养有哪些优点？答：可以避免在分批发酵中因次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态。随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。59与分批培养和连续培养相比补料分批培养具有哪些优点？答：同传统的分批发酵相比，它的优越性是明显的。首先它可以解除营养物基质的抑制。产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应（葡萄糖效应-葡萄糖被快速分解代谢所积累的产物在抑制所需产物合成的同时，也抑制其他一些碳源、氮源的分解利用）。对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，还可以在某些情况下减少菌体生成量，提高有用产物的转化率 在真菌培养中，菌丝的减少可以降低发酵液的粘度，便士物料输送及后处理；与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题，其适用范围也比连续发酵广。60请叙述连续发酵的优缺点及应用。答：其优点是： 设备的体积可以减小； 操作时间短，总的操作管理方便，便于自动化控制； 产物稳定，人力物力节省，生产费用低。缺点是： 对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高； 营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低； 杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。连续发酵的应用：1906年已有啤酒连续发酵的方案，但直到1967年才得到工业化的应用。主要应用国家有新西兰、英国等。由于菌种易变异和杂菌的污染以及啤酒的风味等问题，使啤酒连续发酵工艺的推广受到限制。传统与现代发酵工程的区别 答：.前操作对象是微生物，现代发酵的加工对象生物除此外还有动植物细胞等。.无菌概念已由原来的将杂菌排除在发酵系统外的单向概念转变为同时要求发酵系统内的生物体不能逸出系统外的双向概念。.发酵的培养技术由简单的通气搅拌技术发展到根据生物的类型、目的产物的特征不同而采用更复杂的培养技术，并引用了生化工程放大概念。.发酵培养装置已不仅是标准发酵罐，而是形式多样结构各异的新型生物反应器。61发酵操作方式可分为分批、流加和连续三种，试述三种方法的优缺点答：一、分批发酵 优点：操作简单，周期短，染菌机会减少和生产过程，产品质量易于控制。 缺点：产率低，存在基质抑制问题，出现二次生长现象，对基质敏感的产物，或者次级代谢 产物，抗生素，不适宜用分批发酵。 二、流加发酵 优点：1能维持适当的发酵条件2减缓代谢有害物的不利影响3避免快速利用碳源的阻遏效应。缺点：没有物料取出，产物的积累最终导致比生长率的下降，有物料的加入，增加了染菌的机会。三、连续发酵 优点：设备利用率高，单位时间产量高，容易控制，可及时排除发酵过程中的有害物质。缺点：由于长时间不断向发酵系统加入物料，增加染菌几率，连续发酵时间长，容易产生菌种突变。62简述发酵过程进行中间补料的原则.答：菌体生长代谢需要一个合适的浓度，过高的浓度对菌体生长有抑制作用，过低，不能满足产物合成的需要。中间补料的原则是使生产菌在分泌期有足够多而不过多的养料，使代谢活动朝着有利于合成产物的方向发展。63工业上培养基灭菌为什么常常采用高温瞬时灭菌法？答：因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率;由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；适宜于自动化操作；降低了操作人员的劳动强度64影响培养基灭菌的因素有哪些？间歇灭菌和连续灭菌各自的优缺是什么？答:1、影响因素：培养基成分，培养基的物理状态，培养基的PH，培养基的微生物数量，微生物细胞中含水量，微生物细胞菌龄，微生物的耐热性，空气排除情况，搅拌，泡沫2、间歇灭菌和连续灭菌的优缺点 连续灭菌优点1、灭菌温度高，可以减少培养基营养物质的损失2、操作条件恒定，灭菌质量稳定3、易于实现管道化和自控操作4、避免反复的加热和冷却，提高了热的利用率5、发酵设备利用率高 缺点1、对设备的要求高，需另外设置加热冷却装置2、操作较麻烦3、染菌机会多4、不适合于大量固体物料的灭菌5、对蒸汽的要求高 间歇灭菌 优点1、设备要求低，不需另外设置加热冷却装置2、操作要求低，适于手动操作3、适合于小批量生产4、适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌 缺点1、培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降2、需进行反复的加热和冷却，能耗较高3、不适合于大规模生产过程的灭菌4、发酵罐的利用率极低65请分析介质过滤空气除菌法的基本原理答：气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生撞击，拦截，布朗扩散，重力及静电引力等作用，从而把微生物微粒截留，捕集在纤维表面上，实现了过滤的目的。66工业上空气除菌所用过滤介质（如棉花、玻璃纤维、活性炭等）的滤孔远大于菌体，为何也能达到除菌的目的？空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。介质过滤机理：(1)惯性碰撞作用：当微生物等颗粒随空气以一定速度流动，在接近纤维时，气流碰到纤维而受阻，空气就改变运动方向绕过纤维继续前进。由于微生物等颗粒具有一定质量，因而在以一定速度运动时具有惯性，当碰到纤维时，由于惯性作用而离开气流碰在纤维表面上，由于磨擦、粘附作用，被滞留在纤维表面，这叫做惯性碰撞滞留作用。（2）拦截滞留作用：当气流速度降低时，微粒随低速气流慢慢靠近纤维，随主导气流绕过纤维前进，并在纤维周边形成一层边界滞留区，在滞留区内气流速度更慢，进入滞留区的微粒缓慢接近纤维并与之接触，由于磨擦、粘附作用而被滞留。（3）布朗扩散作用：很小的微粒（1m)在流动速度很慢的气流中能产生一种不规则直线运动，称为布朗扩散运动。其结果使较小的微粒凝集成较大微粒，增加了微粒与纤维接触滞留的机会。（4）重力沉降作用：当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就会沉降。对于小颗粒，只有当气流速度很低时才起作用。（5）静电吸附作用：许多微生物和孢子都带有电荷。当具有一定速度的气流通过介质滤层时，由于磨擦作用而产生诱导电荷，特别是纤维表面和用树脂处理的纤维表面产生电荷更显著。当菌体所带的电荷与介质的电荷相反时，就发生静电吸引作用。67实验室常用灭菌方法：1、 化学灭菌：利用化学药品的氧化作用或损伤细胞作用于微生物而将其杀死的方法。 针对：环境、皮肤、器材等。2、射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线穿透微生物细胞进行灭菌的方法。 针对：无菌室、接种箱等。3、干热灭菌：利用热空气将为生物体内的蛋白质氧化的方法（160保温1h）。针对：玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品。4、湿热灭菌：利用饱和湿热蒸汽是微生物体内蛋白质变性进行灭菌的方法（1212030min）。针对：培养基、发酵设备、附属设备、管道等。优点：蒸汽来源容易、成本低、本身无毒高温蒸汽穿透力强、加速蛋白质变性和微生物死亡、灭菌彻底操作简单细胞内蛋白质含水量高、易变性。（最常用、最有效的灭菌方法）5、过滤除菌：利用过滤方法阻留微生物的方法。针对：制备无菌空气。6、火焰灭菌（灼烧灭菌）：（最简单的干热灭菌法）在火焰上灼烧的方法。 针对：接种针、刀、镊、玻璃棒、三角瓶等。68培养基的灭菌方法：1、分批灭菌（间歇灭菌、实罐灭菌）：升温、保温、冷却。实消：分批灭菌，就是将配置好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通过蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定的时间，再冷却至接种温度，这一过程称之为实罐灭菌。优点：无需专门的灭菌设备，设备投资少；灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低灭菌温度低。缺点：时间长而对培养基成分破坏大；操作难于实现自动控制。2、连续灭菌（高温瞬时：使蛋白质变性；保护营养成分、灭菌）连消：连续灭菌，将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流灭菌后进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。优点：采用高温快速灭菌法；可以把培养基按其性质分开灭菌；有利于自动控