人教版选修1 5.3 血红蛋白的提取和分离 课件（60张）.pptx

课题三血红蛋白的提取和分离,专题五dna和蛋白质技术,学习目标,主要概念：凝胶色谱法电泳法缓冲溶液主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理课题重点：凝胶色谱法的原理和方法课题难点：样品的处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。,课题背景,蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的相继完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中o2和co2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。,血红蛋白,含量,组成元素,分子质量,基本单位,氨基酸连接方式,细胞中含量最多的有机物,c、h、o、n等,高分子化合物，分子量很大,氨基酸,结构通式：,种类：20种,脱水缩合,一个氨基酸的氨基（nh2）和另一个氨基酸的羧基（cooh）相结合，同时脱去一分子h2o,钛键,分子结构,蛋白质结构的多样性,氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别,蛋白质功能的多样性,运输、调节、免疫、催化等，生命活动的承担着,基础知识,基本思路,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,基本原理,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,凝胶实际上是一些微小的多孔球体。如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。,凝胶色谱法,概念：,凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析。,凝胶：,血红蛋白的分离方法,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离,原理：,凝胶色谱分离蛋白质的具体过程,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,血红蛋白的分离（鉴定）方法,电泳,概念：,原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的ph下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,依据：电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖。,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳,类型：,琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物等，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。,聚丙烯酰胺,丙烯酰胺和交联剂n,n-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下发生交联共聚反应形成,蛋白质在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,sds（十二烷基硫酸钠）能与各种蛋白质形成蛋白质-sds复合物，sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,sds聚丙烯酰胺凝胶电泳（分子量测定）,sds能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在sds的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量,讨论：如何测定蛋白质的分子量？,使用sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,缓冲溶液,在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,作用：,能够抵制外界的酸或碱对溶液的ph值的影响，维持ph基本不变。,配制：,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同ph范围内使用的缓冲液。,常用：,nah2po4/na2hpo4,h2co3/nahco3,你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,磷酸缓冲液；目的：是利用缓冲液模拟细胞内的ph环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。,思考：,生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的ph下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程就必须保持体外的ph与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和ph的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。,在生物化学的研究工作，为什么要配制缓冲溶液和准确测定缓冲溶液的ph？,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,样品处理,实验步骤,粗分离,纯化,纯度鉴定（电泳）,红细胞的洗涤,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,透析去除样品中分子量较小的杂质,用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质,sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳,样品采集,样品处理,1.用鸡的红细胞提取dna，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有dna，便于进行dna的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,2.血液有哪些成分？,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,采集血液样品,注意：加入抗凝血剂柠檬酸钠,红细胞的洗涤,洗涤目的,去除杂蛋白（血浆蛋白）利于后续步骤的分离纯化,洗涤方法,采用低速短时间离心，如500rmin,离心2min然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9的nacl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。,为什么要采用低速短时间离心？,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,能否用蒸馏水代替生理盐水？,不能；生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起加大分离难度。,血红蛋白的释放,将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。,思考：蒸馏水和甲苯有什么作用？,蒸馏水的作用：使红细胞大量吸水胀裂甲苯的作用：溶解红细胞的细胞膜,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,分离血红蛋白的溶液,将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000rmin的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层：,用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,粗分离,-透析（去除分子量较小的杂质）,取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（ph为7.0）透析12h,1、透析袋的本质是什么？2、透析的原理？,半透膜：玻璃纸、肠衣、膀胱膜。,透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。,-凝胶色谱（去除相对分子量较大的杂质蛋白）,纯化,凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。,注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面否则难以铺实尼龙网还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,凝胶色谱柱的制作,凝胶的选择：a、材料：交联葡聚糖凝胶（g-75）凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填,凝胶色谱柱的装填方法：a、固定：将色谱柱装置固定在支架上。b、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。c、洗涤：用300ml缓冲液充分洗涤12h注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在。因为空隙或气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,装配好的凝胶柱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,样品的加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动,加透析样品,样品渗入凝胶床,加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,洗脱和收集,小心加入物质的量浓度为20mmoll的磷酸缓冲液(ph为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,操作提示,红细胞的洗涤,色谱柱填料的处理,凝胶色谱柱的装填,蛋白质的分离,观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,结果分析与评价,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,1.以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()a洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂b猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少c血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测d在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,随堂练习,【解析】洗涤红细胞时，洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化，加入的是生理盐水，可防止红细胞破裂，a正确；哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少，b正确；血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，c正确；在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白的分子量比杂蛋白大，质量越大的，通过凝胶色谱柱的速度越快，d错误。【答案】d,2.将处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是()a血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、细胞破碎物沉淀层b甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层c脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物沉淀层d甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层,【解析】将处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min的速度离心10min后，